免疫荧光组织化学间接法

(1)检查抗原法：第一抗体不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段(有种属特异性)作为抗原免疫动物，制备抗抗体。即第二抗体。并用荧光素标记第二抗体。

反应时，首先用特异性抗体(第一抗体)与组织细胞中的相应抗原反应，然后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记的第二抗体与结合在抗原上的第一抗体结合，形成抗原―抗体―荧光抗体复合物。

由于结合在抗原―抗体复合物上的荧光抗体数量显著多于直接法，从而提高了反应的敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个第一抗体分子，当此抗体作为抗原时，每一个抗体分子又可结合3～5个荧光标记的第二抗体分子，故与直接法相比，荧光亮度可增强3―4倍。

此法只需制备有种属特异性荧光标记的第二抗体，可与多种特异性第一抗体相匹配，故目前应用最为广泛。

免疫荧光细胞化学间接法

(2)检查抗体法：常用检查抗体的间接法有两种：一种是先将特异性抗原与组织细胞内 抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细 胞抗体与荧光抗体之间。故称为夹心法(sandwich method)。

另一种方法是在已知抗原的细胞或组织切片上加入待检血清，如果血清中含有细胞或组织切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上形成沉淀。

再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体进行反应(如检测人血清中的抗体必须用抗人IgG荧光抗体等)，利用荧光显微镜即可见抗原抗体反应部位呈现明亮特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。