间接法免疫荧光组织化学染色步骤

1．检测抗原法以单层细胞培养标本为例介绍此法的染色步骤：

(1)取出细胞贴附生长的小盖片，用预热的PBS冲洗2次；

(2)4％多聚甲醛(或冷丙酮)固定5～10分钟，晾干；

(3)0．01MPBS(pH 7．4)漂洗3次，每次5分钟。

(4)0．3％Triton X-100孵育，室温20分钟，PBS漂洗2次(细胞膜抗原可省略此步骤)；

(5)非免疫血清(或15％小牛血清)孵育，室温10分钟；

(6)滴加特异性一抗(如小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体，l：200稀释度)，4℃过夜或37℃孵育30分钟，BS漂洗3次，每次5分钟；

(7)滴加与第一抗体种属匹配的荧光素标记二抗(如羊抗小鼠FITC-IgG。1：100)，37℃避光孵育30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；

(8)Hoechst 333442复染细胞核15～20分钟(不是必需步骤)；

(9)甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下镜观察；

(10)结果分析：波形蛋白免疫反应阳性细胞胞质呈现绿色荧光，如细胞核复染后可呈现亮蓝色荧光。阴性细胞仅见细胞核为亮蓝色荧光。

荧光免疫细胞化学染色

原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞，波形蛋白免疫反应阳性细胞呈绿色荧光（FITC标记二抗)

注意事项：

①如标本为甲醛固定的组织切片，需增加抗原修复步骤；

②对于易脱片的细胞样品在固定后增加晾干时间，可起到防脱片的作用；

③如果结果分析显示有非特异性染色，则需在正常血清封闭之后再用5％牛血清白蛋白封闭。

(1)切片或涂片固定后，置于染色湿盒内，滴加未标记的特异性抗原于标本表面，37℃孵育30分钟，PBS漂洗2次，每次5分钟。用吸水纸吸去残留液体；

(2)滴加荧光标记抗体37℃孵育30分钟，PBS漂洗同上；

(3)甘油磷酸缓冲液或抗淬灭剂封固，荧光显微镜下检测。