间接法免疫荧光组织化学染色步骤
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间接法免疫荧光组织化学染色步骤
1.检测抗原法以单层细胞培养标本为例介绍此法的染色步骤:
(1)取出细胞贴附生长的小盖片,用预热的PBS冲洗2次;
(2)4%多聚甲醛(或冷丙酮)固定5~10分钟,晾干;
(3)0.01MPBS(pH 7.4)漂洗3次,每次5分钟。
(4)0.3%Triton X-100孵育,室温20分钟,PBS漂洗2次(细胞膜抗原可省略此步骤);
(5)非免疫血清(或15%小牛血清)孵育,室温10分钟;
(6)滴加特异性一抗(如小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体,l:200稀释度),4℃过夜或37℃孵育30分钟,BS漂洗3次,每次5分钟;
(7)滴加与第一抗体种属匹配的荧光素标记二抗(如羊抗小鼠FITC-IgG。1:100),37℃避光孵育30分钟,PBS漂洗3次,每次5分钟;
(8)Hoechst 333442复染细胞核15~20分钟(不是必需步骤);
(9)甘油磷酸缓冲液封片,荧光显微镜下镜观察;
(10)结果分析:波形蛋白免疫反应阳性细胞胞质呈现绿色荧光,如细胞核复染后可呈现亮蓝色荧光。阴性细胞仅见细胞核为亮蓝色荧光。
荧光免疫细胞化学染色
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞,波形蛋白免疫反应阳性细胞呈绿色荧光(FITC标记二抗)
注意事项:
①如标本为甲醛固定的组织切片,需增加抗原修复步骤;
②对于易脱片的细胞样品在固定后增加晾干时间,可起到防脱片的作用;
③如果结果分析显示有非特异性染色,则需在正常血清封闭之后再用5%牛血清白蛋白封闭。
2.检测抗体法
(1)切片或涂片固定后,置于染色湿盒内,滴加未标记的特异性抗原于标本表面,37℃孵育30分钟,PBS漂洗2次,每次5分钟。用吸水纸吸去残留液体;
(2)滴加荧光标记抗体37℃孵育30分钟,PBS漂洗同上;
(3)甘油磷酸缓冲液或抗淬灭剂封固,荧光显微镜下检测。