免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：间接法

一、原理与意义

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——间接法，是一种荧光抗体染色法。该方法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

二、操作流程

（一）双层法（Double Layer Method）

1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

2、再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

3、对照染色

①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。

②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。

③阳性对照。

（二）夹心法：未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

1、切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

2、滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。

3、缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。

4、滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。

5、如③水洗。

6、缓冲甘油封固，镜检并拍照。