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HRP 底物分类

Elabscience

264

底物范围较广,包括二氨基联苯胺 (DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

二氨基联苯胺/金属盐

DAB 是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物,在水和醇中不溶解。多数情况下,推荐在 DAB 中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中,辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色,且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。

1. 需要的溶液和特殊设备

DAB,0.05 mol/L Tris 缓冲液 (pH7.6), 0.3% (W/V) 氯化镍/水贮存液, 30% 过氧化氢, DPX, 光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).

2. 操作步骤

(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris 缓冲液 (pH7.6)溶解 6 mg DAB;

(2) 加 l mL 0.3%(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代);

(3) 加0.1 mL 3% 过氧化氢。过氧化氢一般以 30% 的溶液提供,贮存在 4 ℃,此条件可以持续 1 个月;

(4) 如果出现沉淀,用滤纸过滤;

(5) 加此溶液至标本,并孵育1~20 min 水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要可复染;

(7) 用 DPX 封片。

氯萘酚

氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于 DAB,且产物可溶于醇中。它适用于当 DAB 反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。

1. 需要的溶液和特殊设备

0.03% 氯萘酚,用无水乙醇溶解(贮存在-20℃),0.05 mol/L Tris(pH7.6),过氧化氢,Gelvatol 或者 Mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2. 操作步骤

(1) 氯萘酚贮存液的准备:用 10 mL 无水乙醇溶解 0.3 g 氯萘酚,贮存于 -20℃;

(2) 加 100 μL 氯萘酚贮存液至 10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6);

(3) 加0.1 mL 3% 过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以 30% 的溶液提供,4℃ 可存放 1 个月;

(4) 白色沉淀可用滤纸过滤去除;

(5) 加此溶液到标本中,并在室温孵育 10~40 min,水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要,进行复染,但只可使用水溶性染料;

(7) 用 Gelvatol 或者 Mowiol 封片。

氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(AEC)产生红色产物,其敏感性低于 DAB,但可用于 DAB 反应产生较高背景或要求改变产物颜色的实验。此产物可溶于醇,但不溶于水。

1. 需要的溶液和特殊设备

0.4% AEC用 N,N —二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 0.1 mol/L 乙酸钠缓冲液(pH5.2),过氧化氢, Gelvatol 或 Mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2. 操作步骤

(1) 用 l mL DMF 溶解 4 mg AEC。AEC 在 DMF 中稳定,因此,可以用 100 mL DMF 溶解 0.4 g AEC 作为贮存液备用;

(2) 加 l mL AEC 溶液 至 15 mL 0.1 mol/L 的乙酸钠缓冲液(pH5.2)中,并搅拌;

(3) 加 0.15 mL 3% 过氧化氢于水中。过氧化氢一般是 30% 的溶液提供,在 4℃ 可存放 1 个月;

(4) 用滤纸过滤;

(5) 加此溶液到标本中,并于室温孵育 10~40 min,水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要复染,只可用水溶性染料;

(7) 用 Gelvatol 或 Mowiol 封片。

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