蛋白质纯化所需的生物提取物制备的实验

一、化学法和酶法细胞裂解

微量的细胞裂解经常通过化学法或酶法或二者共同采用来完成。例如, 超声和弗式细胞压碎器 (Frenchpress 均质机) 都不便于用在收集小于或等于 5 mL 的培养液的情况，而且应用这些机械的方法经常会遇到过度的产热和样品被氧化等问题。微量细胞裂解的简化方面的重大进步是以去垢剂为基础的试剂的发展，如 frPer(Chuetal.，1998) 和 BUgBUSter(GrabSkietaL，1999)。这些试剂的使用不需要昂贵的设备，并且作用非常快速和便于使用。是非常方便有效的髙通量的制备细胞提取物的方法。高活性的酶和酶的混合试剂已经被用来提髙裂解效率和降低提取物的由于消化不完全的基因组 DNA 所导致的高黏度。单独使用或联合使用这些商业上可获得的裂解试剂和酶 (表 18.1) 能够有效地裂解细菌、酵母、植物、昆虫和高等真核生物的细胞，并从中提取蛋白质。以去垢剂为基础的从真核细胞和组织中获取提取物和蛋白质富集物以及亚细胞组织、细胞器的方法由 Michelsen 和 vonHagen 在本书的第 19 章中详细介绍。

化学法裂解细胞的另外一个方面的进步是在高通量自动化处理样品方面的应用。改进后的试剂和方法可以不收集细胞，直接从大肠杆菌培养液中提取重组蛋白。（Grabskietal.，2001;2003;StevensandKobs,2004)。传统的蛋白质纯化方法首先需要收集细胞，这一步骤为浓缩细胞并去除其中残余的培养基成分（Burgess，1987;Deutscher，1990;Scopes，1994)。该步骤与一些机械法裂解细胞步骤一样难以自动化和按比例缩小并同时进行多个蛋白质的小量提取。浓缩后的去垢剂为基础的试剂（表 18.1), 如 PopCulture、FaStBreakTMffiB~PER 能够直接与高活性的溶菌酶、核酸酶联合应用，从而克服这些生物工艺上的障碍，实现自动化。高通量的提取和纯化试剂的优势在于不需要多次离心以从培养基中分离细胞和澄清粗提取物，也不需要机械裂解 (Nguyenetal.,2004)。这些创新允许从全部培养基提取物中亲和吸附目标蛋白质，使得细胞培养、蛋白质提取和纯化能够在一个试管中全部完成。

一些细菌裂解试剂中的活性成分是非离子去污剂或兼性离子去污剂（zwitterionicdetergent), 这些试剂的功能是裂解细胞膜和细胞壁结构，削弱细胞的结构以便于通过渗透冲击、冻融、噬菌体溶菌酶或鸡卵白溶菌酶的酶解裂解细胞。除了极少数个例以外，革兰氏阳性菌通过溶菌酶单独处理就能够轻易裂解 (CullandMcHenry,1990)。革兰氏阴性菌很难仅通过溶菌酶单独作用裂解，因为其外侧磷脂双分子层 (lipidbilayer) 必须首先经过可渗透化处理 (permeabilize) 以暴露出其肽聚糖，细胞壁才能被酶降解。Tris 缓冲液中添加的 EDTA 能够使双分子层中大约 50% 的多聚阴离子脂多糖 (polyanionicIipopolysaccharide) 暴露出来 (Lieve，1974)。但是 EDTA 会干扰固定化金属亲和层析 (immo

bilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)，而后者是重组蛋白下游纯化中最常用到的步骤。去垢剂型裂解试剂对细胞外膜渗透化处理非常有效，而且不会对 IMAC 产生干扰。然而去垢剂为基础的细胞裂解试剂有几个缺点，一些用去垢剂提取的蛋白质的溶解性可能会由于去垢剂与蛋白质的相互作用而得到提高。这些蛋白质溶解性高低取决于去垢剂与蛋白质的比例。用这些去垢剂提取一些特定蛋白质的溶解性可能会与以放大的机械性方法提取的蛋白质的溶解性不符。去垢剂和去垢剂中的杂质会干扰下游纯化过程和最终的结构鉴定 (Swidereketal.，1997)，而且应该避免使用基于疏水作用的层析分离方法 (Marshaketal.，1996)。尽管存在这些缺点，以去垢剂为基础的裂解试剂仍然广泛地应用于现代的基因组学之中。需要被裂解的细胞的结构决定了工作中所需的去垢剂的化学性质和浓度, 在这些裂解试剂中的去垢剂确切的类型和浓度均已被专利保护。本章所提到的几篇文献（Neugebauer,1990;ChuandMallia，2001;EshaghietaL，2005;Kashino,2003) 在蛋白质提取和増溶方面提供了很有价值的信息，按照配方合理地配制提取试剂便可很方便地完成相关操作。

酵母比细菌更加难以裂解。它们致密而复杂的细胞壁占细胞干重的 25%。典型的成分是通过共价键、二硫键、氢键和疏水作用力相互交联的葡聚糖类、纤维素、甘露糖蛋白和壳多糖。为了较为高效地裂解细胞, 酵母菌应该在对数生长晚期和稳定生长早期收集，因为进入稳定生长期时间越长的酵母菌的细胞壁越厚，而且出芽酵母菌 (buddingyeast) 的细胞壁上也会出现密集的芽痕 (buddingscar) 或芽体 (aggregate)。应该在裂解缓冲液或商业化的裂解试剂之中添加蛋白酶抑制剂, 也可以采用蛋白酶缺陷的菌株来表达蛋白质。还可以采用如 Y-Per 和 YeastBuster(表 18.1) 这样的试剂来裂解酵母菌。通过控制操作那些在细胞壁合成 (biogenesis) 过程中起作用的基因来裂解酵母的新方法是以前已经成熟的机械法和酶法裂解酵母的补充 (Drottetal.,2002)。

相比较机械法和化学法而言，酶法处理微生物细胞使之裂解并降低裂解物的黏度有几个显著的优点: 水解酶对目标细胞的细胞壁成分具有高度特异性, 它们作用温和，不产生剪切力; 不会导致高温或氧化等作用的破坏; 操作过程中不需要特殊的专用器械。酶法处理细胞、提取蛋白质可以与机械裂解法相结合来提高目标蛋白质释放的选择性，提高提取物的产量和获取速率，减小对产品的损伤，降低黏度以利于下游操作（Andrewsand 八祀拉〇，1987;0 炫匕 31^&1&1.，1999)。改良的生物工程酶类和酶制剂 (表 18.1) 包括具有高度特异活性的噬菌体溶菌酶，如 rLysozyme、Ready-Lyse; 重组的溶菌酶和非特异性的核酸酶，如 Benzonase 和 OmniCleave; 溶菌酶-核酸酶混合剂（cocktails)，如 Liquisonic、Lysonase 和 EasyLyse，重组的溶菌酶 Ready-Lyse 和 rLysozyme 樓菌体裂解酶具有高特异的比鸡卵白溶菌酶高出 200 多倍的活性。浅色锯杆菌 (Serraiiamarc-esem) 的核酸酶，可用的有高纯度的重组酶 Benzonase，是已知的最无特异性的 (promiscuous) 核酸酶。这种酶能够消化所有形式的 DNA 和 RNA(Meissetal.，1995;NestleandRoberts，1969)。相比较牛胰脱氧核糖核酸酶 KbovinepancreaticDNaseI) 而言，Benzonase 更加平等地攻击各种底物，这使其对于降低由于 DNA 所导致的提取物的黏度方面具有出色的选择性。Zymolase 和葡聚糖酶类溶细胞酶 (lyticaseglucanase) 是对于酵母菌细胞裂解及酵母原生质体的获得方面非常有用的酶类。

酶法处理的潜在问题限制了其应用，特别是在工业化规模的细胞裂解方面。这一问题包括添加的水解酶本身及酶制剂中所含的其他成分使下游的纯化变得复杂化；回收产物在裂解时发生降解; 水解酶的最适温度、pH 可能与目标产物不相兼容等。大多数水解酶在应用上的限制性和昂贵的价格妨碍了它们在工业规模上的应用 (Hopkins，1991)。

二、机械法裂解细胞

超声和高压裂解已经被高效地应用于微生物、植物和动物细胞的裂解。这些方法已经采用了几十年，其设备和原理已经被详细阐明（Harrison,1991;Hopkins，1991;Mid-delberg，1995)。超声裂解是通过调谐的探头或机臂的共鸣（15~25kHz) 所引发的髙频超声波振荡产生的剪切力来工作的。在音速的压力波作用下，液体中产生微小气泡并随后塌陷，该过程所产生的内爆产生具有足够能量的冲击波从而使细胞壁裂解，并且剪切核酸使样品的黏度降低。

髙压勻浆机 (high-pressurehomogenizer) 和压力挤出机 (pressureextruder) 是通过使强制加压后的细胞悬液通过狭窄的孔口阀 (orificevalve) 来工作的。这种阀可能只是一个简单的限流针孔阀 (restrictingneedlevalve)(如弗氏细胞压碎器），也可能是更加复杂的带有组合的阀座和冲击环的设计 (如在 APVManton-Gaulin 匀浆机中）。裂解的机制是借助于在压力挤出的喷嘴处的压差和剪切力来裂解细胞。压力勻浆机裂解细胞的多种机制已经被提出，包括紊流 (turbulence)、空化 (cavitation)、黏性剪切（viscousshear) 和碰撞 (impingement)(KleinigandMiddelberg，1998;Pandolfe，1999)。普遍认为在破碎过程中并不存在完全单一的作用机制。然而，空化和碰撞被认为是细胞裂解的主要作用因素（Shirgaonkaretal」1998;SPXCorp.，2009)。

用玻璃珠研磨悬液中的细胞来裂解细胞是在实验室规模和生产规模下都比较常用的操作步骤，如上文所提到的玻璃珠研磨机法（球磨机法，beadmilling) 和玻璃珠勻浆法 (beadhomogenization), 玻璃珠研磨机法可以在实验室内利用简单的像电磁搅拌器、涡旋混合器或搅拌器来进行操作，也可以采用市售的专用的高速研磨机、振荡器和搅拌器来完成。细胞裂解程度与细胞浓度、珠子的直径和材料、珠子在悬液中所占的比例、处理时间和所受到的作用力相关 (Ramananetal.，2008)。这种方法对于一些很难裂解的细胞，如酵母菌、孢子、微藻类 (microalgae) 效率很高，已经成功应用于细菌、植物、动物细胞的裂解，也在大规模真菌的裂解中被优先采用 (Hopkins，1991)。已经有人对球磨机方法的过程和原理进行了综述 (Harrison,1991;Middelberg,1995)。一般来说，细胞通过与研磨剂及反应池本身相接触被挤压，研磨、产生的剪切力使细胞被裂解。

机械法裂解细胞技术所需的专用机器经历了功能上的革新，出现了很多新的设备。

大多数机械法不易于应用在 5 mL 或更少的培养基所回收的细胞的处理，而且过度的产热和氧化作用也是机械法裂解细胞所常见的问题。虽然在某些案例中，纯化过程中所残留的去垢剂可能会对蛋白质的生物化学性质或晶体学性质产生干扰，但是 96 孔板和其他型号微孔板专用的多头超声探头（96-wellsonicatorheadandmicroplatehorn) 已经得到了应用（Misonix，Inc.Farmingdale，NY;www.misonix.com)。这种物理的高通量的细胞裂解方法是行之有效的。SonicMan 高通量超声系统（MatriCal，Inc.Spokane，WA;www.matrical.com) 是分为％ 孔、兇 4 孔或 1536 孔的单独或组合的系统单元。该系统采用触屏控制，并采用了一次性垫圈销盖 (disposablegasketedpinlid) 来防止孔和孔之间的交叉污染，还有微孔板滑道可以使其直接进入到自动操作站内。其他新的超声仪，如 BioSpec 的产品是无线的手持 Sonozap 超声波勻浆机。1/8 英寸直径的自动调谐探头应用在 0.3~5 mL 小量样品上是很理想的。PressureBioscience(www.pressurebiosciences.com) 公司研究出了台式（benchtop) 的 Barocycler、手持的 PCTShredder 样品制备系统。这些设备能够在专用的 PULSE 管中形成快速、高压力 (最高可达 35kpsi) 环流。这种 1.2~I.5 mL 的管内带有冲压的 (ram) 有孔的圆盘 (lysisdisk)，这些圆盘使流体产生很高的压力，从而很容易就能裂解植物、动物、昆虫和微生物的细胞（Garrettetal_，2002)。FastPrep(快速核酸提取仪）（MPBiomedicals，Irvine，CA;www.mpbio,com)、Geno/Grinder(SPEXCertiprep，Inc.，Metuchen，NJ;www.spexcsp.com)、Mag-NALyser(RocheDiagnostics，Penzberg,Germanywww.roche.com)、Mikro-Dismem-brator(SartoriusStedimBiotech,Aubagne,France；www.sartorius-stedim.com)^MiniBeadBeaterCBioSpecProducts,Bartlesville,OK；http：//www.biospec.com)RetschMixerMill(RetschGmbH,Haan,Germany;www.retsch.com) 等产品包含了处理几毫升体积样品的所有类型的球磨机。这些设备不具有真正意义上的高通量，但是能够高效地处理 1~5 mL 体系中的极不易裂解 (recalcitrant) 的细胞。

微流体匀裝机（microfluidicsmicrofluidizer)(Newton,MA;www.microfluidicscorp.com) 不同于其他类型的高压勻浆机。这种设备通过气压泵作用使细胞悬液通过固定几何形状的微孔道，从而使之加压、加速及分流。之后当离开装置出口时两股高速运动的流体直接相互碰撞产生高剪切力和压差以裂解细胞。微流体勻浆机型号从适合实验室用的能够处理 25 mL 小量样品的 M-110P，到生物制药工业规模的、处理量达到 900L/h, 具有完整的过程控制监控器，支持 CIP 的 M-700, 这一系统已经在 21CFR 和环鸟苷酸 (cGMP) 等产品上得到了验证。ConstantSystemsLtd.(LowMarchDaventry，Northants，England;www.constantsystems.com) 设计了液压传动的裂解设备，这种设备的功能类似于原始的弗氏细胞压碎器，通过施加歧化力（disruptiveforce) 使物料在压力作用下挤出，但不同的是其参数可调，裂解过程可以控制, 并且具有很好的重现性。ConstantSystems 的设备系列从单次上样（每次 1~20 mL) 工作台到连续处理 (405~565 mL/min) 模式均可提供，包括触屏监测和控制、冷却夹套和在位清洗/在位灭菌 (CIP/SIP) 等功能。Avestin，Inc.(www.avestin.com) 提供的 EmulsiFlex 高压匀浆机处理量为 I.0~

1000L/h。这种匀浆机采用气栗或电动活塞泵, 产生的裂解压力为 500~30000psi。这些设备都配有为细胞提取物降温的热交换设备，并且能够进行 SIP 在位灭菌以符合生产企业的药品生产质量管理规范 (GMP) 要求。Glas-Col，LLC(TerreHaute，IN;www.

glascol.com) 公司的 BioNeb 细胞裂解系统采用 10~250psi 的压力进行气压喷雾以裂解 (breakopen) 细胞, 这种方法的好处是不会产热。雾化孔道里的层流产生使细胞裂解的剪切力，这种力的大小与所采用的压力、气体的类型 (氩气<氮气<氦气) 和流体的黏度等因素相关。雾化后的液滴越小，物料黏度越高，采用的气压越高，所产生的剪切力越大 (Surzyckietal.,1996)。

三、结束语

如果能够根据细胞的类型和规模进行适当的调整，本章中所介绍的细胞裂解的方式、试剂和设备都是可用且高效的。但一定有人会问: 在具体的某一项应用中，哪种方法才是最佳的？针对这个问题，已经有人对细胞的裂解方式与所得到的提取物中的蛋白质含量之间的关系进行了研究 (BenovandAl-Ibraheem，2002;DeMeyetal.，2008;Guerlavaetal.，1998;HoetaL，2008)。高压勻浆机和球磨机等物理方法对于大规模的裂解来说是最佳的方法，因为这类方法效率高、成本低，能够快速地对不同体积的物料进行处理。

超声法、化学试剂法 (包括去垢剂、酶法处理)、冻融法及酶法与化学法或物理法相结合的裂解方法也是非常高效的，在实验室里经常用到，尤其是小体积情况下。每种蛋白质的独特性和不同的宿主细胞结构的差别，使细胞裂解和提取物制备技术的选择及优化很大程度上是依赖于经验的。然而，总是可以找到能够成功地提取和制备生物制品的工具及方法，并且这些方法总是与现代的结构和功能蛋白质组学的需求同步发展的。

四、细胞裂解的流程、试剂和技巧

下文所述的以细胞提取物的产品质量为出发点的各种策略和指导方针适用于大多数下游纯化及分析过程。尽管介绍的重点是在小规模或较大的实验室规模的大肠杆菌裂解上，但是一些技术还是可以用于其他来源的细胞裂解和细胞内蛋白质提取，并且是可以放大的。广泛的蛋白质纯化方面的文献为这里列出的一些蛋白质提取物制备方针及蛋白质纯化和鉴定提供了补充信息 (Burgess,1987;Deutscher,1990;HarrisandAngal，1989;Hopkins，1991;Marshaketal.，1996;Scopes，1994)。

缓冲液成分

细胞裂解缓冲液的成分和体积不仅对细胞的有效裂解至关重要，而且还将影响随后的纯化过程及目标蛋白质从细胞中释放出来后的稳定性和回收率。每种提取的蛋白质都是独特的，理论上应该有一种与其自身的生化性质和预期的纯化流程都相适应的提取及纯化的缓冲液存在。在大多数的案例中，如果几个基本条件符合了, 多数的普通提取缓冲液都能取得很好的结果。这些基本条件包括 pH、离子强度、防止降解和改善稳定性的添加剂、缓冲液与细胞的比例等。一个对于通过缓冲液成分和其他方法保持酶活性的非常好的参考资料是 Scopes(1994) 的蛋白质纯化 (ProteinPurification)。pH 和缓冲液的技术信息都能够通过 Dawson 等 (1986) 找到，其中包括制备 pH1~13 的缓冲液的表格、缓冲液性质和盐的影响、温度、稀释度。

提取缓冲液的 pH 选择应该在蛋白质等电点之上或之下至少一个单位。这种不同于 Pl 的 pH 能够通过保持蛋白质表面的正电荷或负电荷来防止等电沉淀，还有利于离子交换作为纯化的一个步骤。为了保持缓冲能力和最小电导率的增加，缓冲液的离子强度应该为 20~50 mmol/L，所采用缓冲盐类的 pKa 在所采用的 pH0.5 单位以内。典型细胞细胞质的离子强度为 150~200 mmol/L，这其中含有很高浓度的与离子化蛋白质相互作用的带电荷的生物活性分子。裂解缓冲液至少应含有 50~100_ol/L 的 NaCl。提高裂解缓冲液的离子强度将会降低这些离子的相互作用力，并且减少带电粒子的沉淀。这些沉淀会吸附蛋白质，虽可以通过离心或过滤的步骤去除但因此会造成目标蛋白质的损失。最后，缓冲液中应添加可以防止蛋白质降解、提高蛋白质稳定性的物质作为必需的成分。这包括蛋白酶抑制剂 (表 18.2)、还原剂 [如二硫苏糖醇 (dithiothreitol，DTT)]、磷酸三 (P-氯乙基）醋 [tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]、三（3-轻基丙基）膦 [tris(hydroxyprophl)phosphine，THP]、二价阳离子、辅因子、kosmotropes(如甘油、山梨醇或海藻糖)。水溶的无气味磷化氢类的 TCEP 和 THP 都非常稳定，并且比大多数通常使用的硫氢基还原剂/9■巯基乙醇 (浐 mercaptoethanol) 和 DTT 等对保持还原状态的二硫键更加有效 (Clineetal.，2004;Getzetal.，1999;HanandHan,1994)。可以添加非离子的和两性的去垢剂以增加疏水性蛋白质的溶解度。还原剂、蛋白酶抑制剂和去垢剂会干扰一些纯化过程及检验检测分析方法的结果。在选用缓冲液中所采用的化学制剂和其浓度时，这些成分的潜在干扰必须要考虑。对于大肠杆菌细胞裂解所采用的万金油缓冲液 B(bufferB) 为:50 mmol/LTris-HCl 或者是憐酸钠 pH7.5~8,0、50 mmol/L NaCl、5% 甘油、0.5 mmol/LEDTA 和 0.5 mmol/LDTT。推荐采用酵母的裂解缓冲液 (bufferY) 和昆虫细胞的裂解缓冲液 (bufferI) 的配方在下文中会给出。


为了有效地裂解菌体，并保证通过离心和过滤去除不溶的细胞组分沉淀物质后的提取液的回收效率，用来重悬细胞的缓冲液的体积至少要达到原始细胞体积的 3 倍以上。

因为不溶物会吸附约自身体积 50% 的液体，所以至少采用 3 倍体积的缓冲液才能保证最高 85% 的液体回收率。蛋白质在髙浓度下更加稳定，但是高浓度的提取液难以操作，并且会发生蛋白质聚集。尽管裂解缓冲液与细胞体积的比例为 3:1 可以得到浓度更高的提取液, 但是 5~10 倍体积的缓冲液是更加优先选择的，而且能够得到更多的可溶性的蛋白质和更低的提取物黏度。

细胞裂解缓冲液

注意: 在这些缓冲液中，蛋白酶抑制剂可以添加也可以被省略 (表 18.2)，这要看目标蛋白质对蛋白酶水解的敏感性，以及所需要的抑制剂的量和种类。如果起始的蛋白质分离步骤是离子交换色谱法，那么缓冲液 I 和缓冲液 Y 的离子强度可以降低或者提取完毕后再进行稀释。

小规模大肠杆菌细胞裂解规程

1.去垢剂为基础的裂解试剂

10 mL 裂解试剂溶液的配方：10 mLB-Per 或 BugBuster,20/iLLysonaseBioprocessingReagent。如果需要减少蛋白质水解和增加目标蛋白质可溶性及稳定性可以添加，如 EDTA、蛋白酶抑制剂、5%~10% 甘油和还原剂等添加剂。选择缓冲液的成分及其浓度时要考虑到随后的纯化和检测的需要。

(1) 将 ImL 培养基加入 2 mLX96 孔板中, 或者将 5 mL 培养基加入 24 深孔的平板中，并用透气的封口膜或 BugStopperTM 封口帽 (capmat) 封口以培养菌体和表达目标蛋白质。

(2) 离心收集菌体。

(3) 吸出并弃去培养基。

(4) 用移液器重悬菌体于 100~200yL 裂解缓冲液中。

(5) 混合并在摇床上振荡 10 min 以进行反应。

(6) 吸取 10 混合液以进行全菌体裂解物分析。

(7) 离心 5 min 后取出 10 上清液以分析可溶性蛋白质。剩余的上清液则可用于其他分离或分析操作。

(8) 出现在不溶组分中的目标蛋白质的量可以通过比较第（6) 步的全部菌体提取物和第 (7) 步中的可溶性蛋白质之间的差别来间接估计。典型的样品比较方法是电泳、酶联免疫吸附实验 (ELISA) 或酶学分析。不溶组分的直接检测可通过吸出可溶性的上清液后，将剩余的沉淀部分溶于 SD^PAGE 上样缓冲液中之后进行电泳的方式得出。

注意: 制备 SDS^PAGE 的蛋白质样品的程序和技巧在 Grabski 和 Burgess(2001) 中可以得到。这篇文章提供了 SD&PAGE 样品缓冲液的配方、蛋白质样品制备、凝胶上样建议，并且给出了分析难以分析的样品的替代方法。

2.去垢剂为基础的全培养物细胞裂解试剂

10 mL 裂解试剂的配方：10 mLPopCulture、FastBreak 或 B-PerDirect,200yLLysonaseBioprocessingReagent。随后的规程能够在多孔板利用自动液压传动平台来完成，在一块平板上可以采用多通道移液器来对多种培养物同时进行操作。用于将亲和树脂从培养物提取物和经过处理的溶液中分离的多孔过滤板能够从多个制造商获得。利用专门的磁性针板 (magneticpinplate) 或者平台来分离磁珠已获得成功。

(1) 在 2 mLX96 孔的板中加入 ImL 或者在 10 mLX24 深孔的平板内加入 5 mL 培养基培养细胞并表达目标蛋白质，并用透气的封口膜或者 BugStopperTM 封口帽封口。

(2) 添加 1/10 培养基体积的裂解试剂。

(3) 用移液器混合，并在摇床上振荡 10miri 以使反应充分进行。

(4) 取出 50yL 全细胞裂解液混合物以用于分析。样品可采用电泳、ELISA 或酶法分析。直接的 SD^PAGE 分析和考马斯亮蓝染色分析需要髙表达水平和很大的样品上样量或通过沉淀的方法来检测被稀释的蛋白质样品。用特别的滤板 (Pall,Millipore,3M) 能够从蛋白质溶液中去除蛋白质聚集体和包涵体，从而在这一步能够很容易的检测蛋白质的可溶性表达水平。

(5) 直接将平衡好的亲和捕获树脂 (affinitycaptureresin) 或亲和磁珠加入到未经处理的细胞裂解物中。典型的加量为 50~100 ML 凝胶浆 (在捕获缓冲液中含有 50% 的凝胶浆 VmL 起始培养基体积，根据凝胶对重组蛋白的捕获能力和目标蛋白质的表达水平来决定具体添加量。

(6) 用 10~30 倍凝胶体积的漂洗缓冲液来清除杂质。

(7) 用 3 倍体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质。

3.冻融法加酶法裂解

10 mL 裂解试剂的配方:10niL 浓度为 50~100_ol/L 的裂解缓冲液 (采用甘氨酸、乙酸钠、Tris-HCK 磷酸钠或 HEPES 中的某一种取决于所期望使用的 PH)，50~

300mrnol/LNaCl，30jixLLysonaseBioprocessingReagent。例如，EDTA、去垢剂、蛋白酶抑制剂、5%~10% 甘油和还原剂等可以按需要添加到裂解缓冲液中用于减少目标蛋白质的水解, 增加其溶解性和稳定性。当选择裂解缓冲液成分及其浓度时要考虑到下游的纯化及分析过程的要求。

冻融法裂解细胞的效率取决于细胞悬液的密度、冻融的循环数、冰冻的速率。但是实验表明，其对于大肠杆菌中的蛋白质释放的效率低于球珠涡旋法 (beadvortexing)、弗氏压碎器或超声 (BenovandAl-Ibraheem，2002)。然而，当结合溶菌酶裂解时，对于不稳定蛋白质来说其是一种温和的释放方法，并且不需要特殊的装置。缓慢的冻融循环破裂细胞膜，将细胞壁暴露使之与酶接触并被降解。

(1) 将 ImL 培养基放在 2 mLX96 孔板中，或者将 5 mL 培养基放在 10 mLX24 深孔的平板中，并用透气的封口膜或 BugStcwerTM 封口帽封口以培养细胞并表达目标蛋白质。

(2) 离心使菌体形成沉淀。

(3) 吸出并弃去残余培养基。

(4) 将菌体置于_20°C 至完全冰冻。

(5) 用移液器加人 100~200 裂解试剂并重悬菌体。

(6) 将之置于摇床上室温振荡反应 10 min。

(7) 再次将悬液重新置于一 20°C 至完全冻结。

(8) 室温溶解, 混匀，并取出 10fxL 全细胞裂解混合物以备分析。

(9) 离心 5 min, 取出 10juL 上清液以分析可溶性蛋白质，剩余的已经澄清的上清液则可用于其他纯化或检测过程。『’

(10) 不溶组分中目标蛋白质的量可以通过比较第（8) 步获得的全细胞裂解液和第 (9) 步获得的可溶性蛋白质样品之间的差别间接分析得出。典型的比较分析方法是电泳、ELISA 或酶法。不溶组分的直接分析可以通过吸出上清液后，将沉淀部分溶于 SDSPAGE 上样缓冲液中，并 SD^PAGE 分析得出。

克级规模大肠杆菌机械裂解

1.超声

以下所述超声流程适用于 2~50 g 菌体的裂解。

(1) 用已称重去皮的离心桶或离心管 9000 g 离心 15 min 以收集菌体。

(2) 倾出并弃去培养基，将离心桶倒置在纸巾上以去除残余的培养基，记录菌体湿重。

(3) 将菌体置于一 20°C 完全冻结, 并于一周内处理以获得最佳的结果。长期储存菌体应置于一 80°C 以使蛋白酶水解最小化。新鲜的未冻结的菌体也可以使用，但是由于细胞膜还很完整，使得用溶菌酶对菌体进行预处理的效率很低。

(4) 用手持勻浆机在低转速情况下将菌体按照 7~10 mL/g 的比例完全重悬于 4°C 的裂解缓冲液中，避免剧烈的搅拌产生气泡以防止氧化作用。

(5) 可选择的：加鸡蛋中提取的溶菌酶 (0.2 mg/mL) 或重组的溶菌酶（60KU 或 0.2pL/mL) 并添加核酸酶，如 DNaseClOpg/mL) 或 Benzonase(l.0pL/mL)。

(6) 将悬浮液置于玻璃烧杯内，并置于冰上超声 60~90s。通过调整机器设定、探针插入深度和超声持续时间防止过热和打空。注意: 操作时不能使超声探头接触到玻璃烧杯，以防止玻璃破裂。对于 100 mL 菌体悬液来说，用 BransonModelS-450sonifier(BransonSonicPowerCo.，Danbury，CT;www.bransonultrasonics.com) 采用 1/2 英寸直径的探头, 设定 4 组超声，每组 8 次，占空比为 70%，通常就能达到裂解效果。每次超声间隔几分钟, 并置于冰上搅拌。如果需要，在此处取出 5(VL 样品 (在离心之前) 用于分析全菌体的蛋白质。

(7)4°C、15000 g■离心 15 min, 将上清液转移到另一个容器中，小心操作，不要搅动菌体沉淀。依照下一个分离步骤对颗粒的耐受情况，可溶的组分可以通过低蛋白质吸附的滤器过滤进一步澄清。如果采用注射器式滤器 (syringefilter) 进行澄清，可以以串联的方式在上面放置 0.8yin 滤膜，下面放置 0.45 滤膜。大孔径的滤器在流路中首先防止小孔径尺寸滤器处的污垢沉积过快。最终澄清的上清液含有菌体蛋白质的可溶的组分，并且可以直接进行色谱层析或其他下游的分离或分析操作。

2.高压匀浆

下面所介绍的批量化的高压匀浆操作适用于采用 APVGaulin 匀浆机（APVFluidHandling,Delevan,WI;www.apv.com)、Microfluidizer 或 ConstantSystem 的液压破碎仪处理湿重为 50~500 g 菌体的操作。高于 500 g 菌体的裂解应该采用多批次的处理方法，或采用之前所提到的连续的菌体裂解设备。

(1) 接着上面所说的超声处理方法的第 (3) 步和第⑷步的方式重悬新鲜或冰冻的菌体，如果采用瓦林式（Waring) 或小型混合器（WaringProducts，Torrington,CT;WWW.waringproducts.com)，则注意需要低速重悬菌体，不要过度搅拌并且在全程保持提取物处于冷却状态。算上裂解之后漂洗裂解设备的缓冲液，重悬的体积应该少于 10 mL/g 的比例。混合之前，从已经计算好的重悬体积中取出 50~100 mL 的裂解缓冲液放在一边备用。这些缓冲液将用来在样品处理之后冲洗设备。用这些缓冲液冲洗可以将设备死体积中的残余提取物冲出。

(2) 如果采用 Gaulin 细胞裂解器，在裂解大肠杆菌时，在 10000psi 压力下处理两次。当处理难以裂解的菌体，如酵母菌，可能需要更多的处理次数或持续循环处理。如果采用的是 Microfluidizer 或液压式的细胞匀浆机，则按照厂商的操作说明进行操作。在处理过程中，特别是小体积的操作时, 样品会发生非常明显的产热现象。在处理过程中，通过将收集管路浸入到干冰乙醇浴 (dryiceethanolbath) 中将裂解液冷却到 5~10°C。通过持续搅拌和定时将管路从冷浴 (coolingbath) 中移出来减少裂解液在收集管底部和边上的冻结。

(3)4°C、15000 g 离心 30 min 裂解液。倾倒出上清液并用 Miracloth(EMDBiosciences-Calbiochem，Gibbstown,NJ;www.emdbiosciences.com) 将之过滤到另一个容器中，小心不要搅动沉淀。可溶组分按照随后的分离步骤对颗粒的忍耐度可以用较小孔径的低蛋白质吸附的滤器进行进一步澄清。最终澄清的上清液中含有菌体蛋白质的可溶组分，并且可以用于进行色谱层析或其他下游的分离或分析操作。