怎样有效减少His标签蛋白纯化效果不理想的问题？

原因及解决方法：

1：蛋白酶会部分降解目的蛋白，解决方法：加入多种蛋白酶抑制剂改进。

2：杂质蛋白与镍柱亲和力较强，解决方法：可提高杂质蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

3：杂蛋白和目的蛋白结合，解决方法：可通过超声前加入去垢剂或者还原剂消除（1%-2%Tritonx-100）。

4：洗涤不充分，解决方法：增加洗涤的次数，充分洗涤。

1.注意缓冲液的ph值，一般需要中性或碱性条件。2.要根据填料的结合载量来选择柱子和填料的规格。

3.降低裂解液的粘性。4.延长蛋白过柱时间。5.一定要提前做预实验

有各种原因：
1.柱子没平衡好。增加平衡的时间。
2.柱填料有问题换新的。
3.洗脱拉咪唑梯度太大，可以拉梯度更细一些。
4.非特异性吸附多，平衡缓冲液中加20mM的咪唑和400mM的氯化钠减少非特异性吸附

可以试着加入多种蛋白酶抑制剂改进。

1、His标签在中性或碱性条件（pH7~8）下，与Ni2+有更强的结合力，与Tris-HCl缓冲液相比，在磷酸缓冲液中His标签表现出与Ni2+更强的结合力。

2、HisTrap HP和HisTrap FF的蛋白结合载量都是至少40mg (His) 6重组蛋白。大家可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。

3、如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以根据样品体积选择适合的上机脱盐柱（HiTrap Desalting）或者手动脱盐柱。

4、HisTrap预装柱或者填好的柱子储存在20%乙醇中、4℃-30℃条件下。

5、目的蛋白不挂柱主要是因为蛋白和柱子结合能力不足导致的，我们可以从以下几点排查问题。

1、His标签没有充分暴露：在蛋白中加入适量的尿素或盐酸胍等变性剂看下蛋白能不能挂柱，若可以挂柱可以尝试在变性条件下纯化，如果不能接受蛋白变性纯化，那可以在上游分子水平改变His的长度或位置，让His暴露在蛋白表面。

2、His标签是否还在？大肠杆菌外源蛋白表达过程中，有时候会出现序列丢失的现象，如果标签丢失，蛋白自然就无法挂柱了，检测His标签，可直接用His抗体通过用Western-Blot方法检测。

3、缓冲液条件是否合适：如果缓冲液中有EDTA、柠檬酸等金属离子螯合剂，必须要去掉；此外适当提高缓冲液pH、降低咪唑浓度、调整缓冲液中盐离子浓度或者更换缓冲液都可能会提高His标签蛋白的挂柱能力。

4、纯化时蛋白和柱子接触时间过短：可以适当延长蛋白和柱子的接触时间。

5、当流穿液和洗脱液中都有目的蛋白时，可能是由于样品的蛋白超过柱子的载量，这时可以用几个HisTrap柱串联使用；或者更换体积大的柱子。