His标签蛋白纯化效果不理想？小贴士来帮你！

Cytiva（思拓凡）2020-05-20

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His 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。

纯化所得组分中没有收集到重组的His标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面：

1、His标签蛋白没有结合到填料上就流穿了
原因一
超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。
建议
改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。
原因二
结合缓冲液条件不合适。
建议
检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螯合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时，优化缓冲液的pH、盐离子浓度、添加剂（如5%甘油、1mM DTT）等。
原因三
His标签没有表达或丢失或暴露不充分。
建议1
用anti-His的抗体进行WB，检测His标签是否存在。
建议2
将蛋白用4-6M盐酸胍或4-8M尿素变性后，让His标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。
建议3
改变His标签的位置或者增加其数目（常用6-12个His），增加暴露和结合机会。
建议4
改变金属结合离子，除了Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用来进行His标签的捕获。

2、His标签蛋白结合了，但是洗脱不充分
原因一
洗脱条件太温和。
建议
增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱，或者通过降低pH寻找最佳洗脱条件。需要注意的是，pH低于3.5容易导致镍离子脱落。
原因二
蛋白柱上沉淀。
建议1
降低蛋白浓度。可以减少上样量，或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱，增加蛋白稀释度。
建议2
试用去污剂或者改变NaCl的浓度，或者使用变性剂（4-6M盐酸胍或4-8M尿素）在变性条件下洗脱。
原因三
非特异性的疏水或者其他相互作用。
建议
加非离子型去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的浓度洗脱。

是不是很有收获，快去试试吧！