PCR反应所需细菌DNA 模板的制备

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从分析的标本中纯化核酸，即制备PCR反应的模板，是使PCR获得成功的重要的第一步。由于PCR的用途各异，用于抽提核酸的起始材料种类可能差异很大(包括新鲜的、储存的和古代的)。每种特殊样品类型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它们都有一个共同的标准，扩增的灵敏性要求特别注意不同材料、PCR产物、质粒 或对照之间可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度纯化的核酸，为最大限度材料污染的机会，可以使用快速而且简便的提取方法。

【试剂与配制 】

TE缓冲液 (pH8.0)

裂解缓冲液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。

RNase A (10mg/ml)

平衡酚

氯仿：异戊醇(24：1)

无水乙醇

70% 乙醇

3mol/L 乙酸钠(pH5.2)

【操作方法】

1、方法一

(1)从平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量离心管中，加入400μl裂解缓冲液，混匀;

(2)55℃～60℃，水浴15～20min;

(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀;

(4)5000g离心10min;

(5)吸取上层水相，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1);

(6)重复(3)～(4);

(7)吸取上层水相，加1/10体积3mol乙酸钠及RNase A(终浓度为0.25～0.3μg/μl)，轻摇，37℃保温30 min;

(8)加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃ 2hr;

(9)10,000g 离心15min，弃上清，或用无菌细玻棒搅缠出DNA;

(10)70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小体积去离子水或TE缓冲液中(约20μl)。一次取5～10μl进行PCR反应。

2、方法二

(1) 取一定数量的细菌加入500μlTE缓冲液中;

(2) 100℃煮沸10min，置冰浴保存;

(3) 10,000rpm，4℃离心10min;

(4) 取适量上清作为PCR 模板。

3、方法三

(1) 制备一定浓度的细菌/去离子水悬液，反复冻融3次;

(2) 10,000rpm，4℃离心10min;

(3) 取适量上清作为PCR 模板。