细菌DNA PCR反应模板的制备

从分析的标本中纯化核酸，即制备PCR反应的模板，是使PCR获得成功的重要的第一步。由于PCR的用途各异，用于抽提核酸的起始材料种类可能差异很大（包括新鲜的、储存的和古代的）。

每种特殊样品类型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它们都有一个共同的标准，扩增的灵敏性要求特别注意不同材料、PCR产物、质粒或对照之间可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度纯化的核酸，为最大限度材料污染的机会，可以使用快速而且简便的提取方法。

【试剂与配制】

TE缓冲液（pH8.0）

裂解缓冲液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。

RNase A （10mg/ml）

平衡酚

氯仿：异戊醇（24：1）

无水乙醇

70% 乙醇

3mol/L 乙酸钠（pH5.2）

【操作方法】

1、方法一

（1）从平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量离心管中，加入400μl裂解缓冲液，混匀；

（2）55℃～60℃，水浴15～20min；

（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀；

（4）5000g离心10min；

（5）吸取上层水相，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）；

（6）重复（3）～（4）；

（7）吸取上层水相，加1/10体积3mol乙酸钠及RNase A（终浓度为0.25～0.3μg/μl），轻摇，37℃保温30 min；

（8）加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃ 2hr；

（9）10,000g 离心15min，弃上清，或用无菌细玻棒搅缠出DNA；

（10）70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小体积去离子水或TE缓冲液中（约20μl）。一次取5～10μl进行PCR反应。

2、方法二

（1） 取一定数量的细菌加入500μlTE缓冲液中；

（2） 100℃煮沸10min，置冰浴保存；

（3） 10,000rpm，4℃离心10min；

（4） 取适量上清作为PCR 模板。

3、方法三

（1） 制备一定浓度的细菌/去离子水悬液，反复冻融3次；

（2） 10,000rpm，4℃离心10min；

（3） 取适量上清作为PCR 模板。