巨细胞病毒感染小鼠模型的建立

 

基 本 方 案 巨 细 胞 病 毒 感 染 小 鼠 模 型

材 料

B A B L /c 小 鼠（新生或成鼠）或其他品系

纯化的鼠巨细胞病毒（m C M V ; 见辅助方案 1 ) 或 唾 液 腺 病 毒（S G V ，见辅助方案2 )

完全培养基

钢 网（0 •45m m )

Ia.感染新生小鼠：用 10〜IOOpfu 纯 化 的 鼠 C M V 或 S G V 腹腔注射感染新生 BABL/c小鼠，腹部皮下进针，针头近胸腔部位注射。
新生小鼠感染成功至少要用 IOOpfu 病毒。用 IOOOpfu 病毒感染会引起严重的疾病（发育不全、脱毛、生长停止）和高死亡率。

Ib. 感染成鼠：用纯化的 I X l O 5Pfu 鼠 C M V 或 S G V 腹腔注射、皮 下（足垫）注射或者静 脉 注 射（附 件 2E ) 感 染 B A B L /c 成鼠。S G V 具有很高的毒性， B A B L /c 成 鼠 L D 5 0 用量约 lOOOOOpfu。用这个剂量感染小 鼠 会 引 起 严 重 的 并 发 性 肝 炎 。

2 . 分别在第 7、 14、 2 1 天 处 死（附 件 3 G ) 感染的小鼠，取 器 官（如唾液 腺 、脾 、肝;附 件 2 H ) 冻存在塑料管中。 一 70°C 保存各个器官直到测定病毒滴度。

3 . 融化器官，用 注 射 器 的 柱 塞（或其他类似无菌器械）反 复 在 0.45m m 钢网上挤压器官 ，收集培养皿中的匀浆产物，用 大 约 4m l 的完全培养基冲洗钢网并收集，总体积约 为 5 ml。

4 . 立即用细胞空斑形成试验检测组织勻浆稀释液中鼠 C M V 滴 度（辅助方案 3)。

脾 、肝 、肺 脏 中 病 毒 滴 度 峰 值 出 现 在 感 染 小 鼠 后 的 第 11〜 1 4 天 ， 而 在 唾 液 腺 中增 殖 的 病 毒 滴 度 峰 值 出 现 较 内 脏 器 官 中 的 晚 一 些 。

辅 助 方 案 1 巨细胞病毒的准备

材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞（M E F ; 见 辅 助 方 案 4 ) 或 其 他 合 适 的 细 胞（例 如 ， NIH3T 3 ， 1 0 % 〜3 0 % 汇合生长， A T C C # C R L -1658; B A L B /c 3T 3, A T C C # CCL-163； M 2-10B 4, A T C C # C R L -1972)

完全培养基

小 鼠 巨 细 胞 病 毒（m C M V ): Smith 株（A T C C # V R -194， V R -1399) 或者 K 181细胞株

15 % (W V ) 蔗糖/VSB

165 cm2 组织培养皿

一次性的细胞刮刀

离 心 机（例 如 ， Beckman J2-21，转子 JA-10， J A - 1 4 ; 或者 Sorvall R C -5，转子G S 3 ， G S A )

500m l 和 250m l 无菌离心管

Dounce 匀 浆 器 及 研 磨 棒（Kontes 或 Wheaton)

带有外旋转转头的超速离心机（Beckman S W 2 8 或其他相似的）及 20m l 的超速离心管

0.45p m 无 菌 过 滤 器（任选）

1 . 在 165 cm2 组织培养皿中用完全培养基培养 M E F 细胞 ，每 隔 2〜3d ，按 照 1 : 3 的比例传三代。培养至细胞面积占据培养皿面积的 7 0 % 〜8 0 % (细胞培养 2〜3d 后）。

2 . 吸去培养基，加 入 大 约 IO5P f u 经过病毒滴度测定的小鼠 C M V (0. Olpfu/ 个细胞），在 37°C ， 5 % C O 2 孵箱中培养至细胞完全感染病毒（3〜5d)。可观察到培养的细胞变 圆（细胞病变效应， C P E )。

制备未纯化的病毒：仅为细胞释放病毒

3a. 制 备 I m l 和 4m l 含有病毒的上清液保存于一 70°C (可稳定保存一年）。部分用于测定 病 毒 滴 度（见辅助方案 3)。

制备未纯化的病毒：细胞释放的及与细胞内的病毒

3b. 吹 打 细 胞（必要时可用细胞刮刀），收集细胞及上清液。经 过 2〜3 次的细胞反复冻融将包含在细胞里的病毒释放出来。将 部 分 存 储 ，按 照 步 骤 3a 进行病毒滴度的测定。

未纯化的病毒滴度通常大约在 2 X 106pfu/ml。反复的冻融会稍微降低病毒滴度 ，但可使感染的细胞裂解从而释放细胞中的病毒。这样获得的病毒液中由于含有较多的病毒衣壳成分，减少了病毒颗粒的百分含量。

制备纯化的病毒：细胞释放的及与细胞内的病毒

3c. 吹 打 细 胞（必要时可用细胞刮刀），将 细 胞 及 上 清 液 转 移 入 无 菌 的 500m l 离心管(不用反复冻融）。 4°C ， 6400 g 离 心 20 min，将上清液转移到 250m l 无菌离心管中。

4c. (可选）：用 5m l 冷的完全培养基重新悬浮细胞，冰 上 勻 浆 2 0 次裂解 细 胞 。 4°C ，22 OOOg 离 心 IOmin 后 ，将上清液转移进步骤 3c 中的病毒上清液中。

5c. 4°C ， 26 OOOg 离心至少 3 h 收集病毒。弃上清，把带有少量残余培养基的沉淀放于冰上， 4°C 过夜。

6c. 用残留的液体重新悬浮沉淀，冰 上 匀 浆 2 0 次 。把病毒转移至含 18m l 的 1 5 % 蔗糖/V S B 液 的 20m l 超速离心管中。 4°C ，外旋转转头 72 OOOg 离 心 lh。

7c. 轻轻倒掉上清，加 入 4 ml 1 5 % 蔗糖/ V S B 混匀后，冰上过夜。小 心 的 悬 浮 病 毒（如有需要可再次勻浆）。

8c. 可选：用 0.45/x m 无菌过滤器过滤悬浮液，除去病毒的壳体及聚合物。

9c把过滤的病毒液分装成 20jul，保存于一 70°C (可稳定的保存一年）。部分用于测定

病 毒 滴 度（见辅助方案 3)。

由于体积的减少，纯 化 的 病 毒 滴 度 较 高（1 〇 ⁷〜IO⁹pfu/ml) ，但在纯化的过程中，病毒的感染力会降低。反复的冻融也会降低滴度，应尽量避免。

辅 助 方 案 2 唾液腺病毒的制备

材 料（其他材料见基本方案，带 V 项 目 见 附 录 1)

B A L B / c 小 鼠（4〜6 周龄）

PBS

1 . 给 4〜6 周 B A L B / c 小鼠足垫注射 2 X 10⁵Pfu 组织培养来源的病毒。

2.2 周 后 处 死 小 鼠（附 录 2 G ) ，收集唾液腺，混合集中腮腺、较大的舌下腺和下颌腺。保存腺体于一 70°C (可稳定的保存一年）。

3 . 制 备 组 织 匀 浆（见基本方案步骤 3)，用 P B S 代替完全培养基冲洗钢网。整个过程冰上操作。

4 . 测定经过唾液腺组织匀浆中的病毒滴度（见 辅 助 方 案 3)，用 5 X 10⁴pfu 经腹腔内感染新小鼠。

5 . 重复步骤 2〜4 , 至 少 3 次 以 上（生产更多的病毒）。

6 . 从 第 3 次（或更多次）感染的小鼠体内取腺体，集中每次得到的腺体后进行匀浆 20次。 4°C ， 800 g•离心 5 min。

7 . 将上清液转移到一个新的管中，用 3〜5m l 的 P B S 重新悬浮沉淀物，匀 浆 ，再次离心。将上清液收集到一起，分装 成 250〜500^1 冻存于一 70°C (可稳定的保存一年）。

取一小部分测定病毒滴度（见辅助方案 3)。

辅 助 方 案 3 用空斑形成细胞试验测定巨细胞病毒滴度

材 料

小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞（M E F ; 见 辅 助 方 案 4 ) 或 其 他 合 适 的 细 胞（例 如 ，N I H 3T 3, A T C C # C R L -1658； B A L B /c 3T 3, A T C C # C C L -163； M 2-10B 4,A T C C # C R L -1972)

试验样品： C M V 感染的小鼠器官匀浆（见基本方案），小 鼠 C M V 保 存 液（未纯化或纯化，见辅助方案 1)，或 唾 液 腺 病 毒（见辅助方案 2)。

完全培养基

黏稠培养基

倒置显微镜

4 8 孔组织培养板

平 板 离 心 机（可选）

1 . 滴定的前一天接种 M E F 于 4 8 孔组织培养板中，完全培养基培养。需一定的细胞密度接种，待测定时大约长满 8 0 % 。

2a. 对组织器官匀浆液病毒：充分匀浆含病毒的器官组织后，加 入 250ul 的勻浆液到4.75m l 的 完 全 培 养 基（1/20)，进行一系列 Iog1。倍数稀释，从前一个稀释度中吸取500ul 液 体 与 4.5m l 完全培养基混合，每一步都要混匀。对组织培养产生的病毒或唾液腺病毒，稀 释 度 0.5 X 10^-2〜0.5 X 10^-8。

2b 对病毒储存液的稀释：用完全培养基从 10^-3〜10^-10 进行一系列 Iog1。倍数稀释。

3.每孔加入 50(^1 的病毒稀释液，每一个稀释度至少做三个复孔，为增加测定的敏感度 ， 4 8 孔培养板 800^离 心 30 min (可选）后 ， 37°C ，孵 育 lh。

4 . 移去培养基，用无菌的烧杯或者移液管每孔添加 0.5〜1.0m l 黏稠培养基。 37°C ，孵育 4〜 5d。

5 . 在倒置显微镜下进行病毒斑计数，计算出每毫升病毒所形成的病毒斑数（pfu)。在显微镜下，病毒有效感染成纤维细胞后细胞变圆，形成斑点，最后细胞死亡。Ipfu 对应大约 500 病毒。

辅 助 方 案 4 原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备

材 料

孕 鼠（品系不重要）P B S : 无钙镁离子

胰蛋白酶溶液： 0.25% (m A O 胰蛋白酶/lmmol/L E D T A 溶 解 于 P B S 中

完全培养基

无菌的外科手术器械：剪刀、解剖刀、镊子

2〜4m m 的无菌玻璃球

无菌纱布或不镑钢网（〇 .45m m 的格子大小）

165c m 2 组织培养皿或者 175 cm2 组织培养瓶

1 . 采用脱颈的方法处死怀孕 17〜 18d 的 小 鼠（附 录 2 G ) 。 手术取下小鼠的胚胎，尽可能的取下胚胎的肝和肠。

2 . 无菌操作，避免污染。用剪刀或解剖刀在培养皿中切碎胚囊，用 P B S 冲洗组织碎片，去除红细胞和细胞碎屑。

3 . 把组织块转移到 500m l 无菌的锥形瓶中。每 5〜8 个 胚 囊（一层），加 入 30m l 的胰蛋白酶溶液，无菌磁力搅拌，用足够多的 2〜4m m 的无菌玻璃柱覆盖瓶底。 37°C 慢慢摇 动 30m i n 或室温放置约 lh。

4 . 加 30m l 的胰蛋白酶和 IOml P B S 到组织块中， 37°C 搅 拌 30 min。再 重 复 一 次（总共三次加入胰蛋白酶并孵育）。过 量 的 胰 蛋 白 酶 能 降 低 细 胞 的 生 存 能 力 ，相 反 胰 蛋 白 酶 消 化 不 足 会 降 低 细 胞 的得 率 。

5 . 用几层无菌纱布或 0.45m m 不锈钢网过滤细胞液（110 ml)。室温， 250 g 离心细胞悬液 lOmin。弃上清液，用 IOml 的完全培养基重新悬浮沉淀细胞。每 次 搅 动 后 ，在 添 加 胰 蛋 白 酶 到 余 下 的 组 织 碎 片 中 前 ，过 滤 和 离 心（步 骤 5 ) 可以 交 替 进 行 。建 议 超 过 三 次 的 胰 蛋 白 酶 消 化 用 此 方 式 来 提 高 细 胞 的 得 率 。

6 . 用 台 盼 蓝 试 验（附 录 3C) 测 定 活 细 胞 的 浓 度 ，并 接 种 I X IO⁷〜2 X IO⁷ 细胞于165 cm2 组织培养皿或者 175 cm2 组织培养瓶中，在 37°C ， 5 % CO2 孵箱中孵育过夜。

7 . 第 1 天 ，除去培养基和细胞碎屑，添加新鲜的培养基，继续孵育 2d 以上。

8 . 第 3 天 ，当细胞连成一片，冻 细 胞（每一个平皿分成九份）于 液 氮 中（可稳定的保存一年）或者按照 1 : 3 的比例进行传代。第四代细胞可用于繁殖病毒。