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转基因小鼠模型的建立(SOP)

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16804

名称:转基因小鼠模型的建立(SOP)

关键词:转基因小鼠

目的:在动物体研究转化基因

原理:

转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术,它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。

当制备转基因动物时,外源基因可能只整合到动物的部分组织细胞的基因组,也可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物,称为嵌合体动物。此类动物中,只有外源基因整合的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时,转基因才具有遗传性状,否则,外源基因将不能传给子代。

转基因的方法多样,有胚胎干细胞法、逆转录病毒载体法,显微注射法等,此章介绍显微注射法制备转基因小鼠。此法获得转基因动物的数量较多。

(一)显微注射法的基本原理和方法

转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞),然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中,使其发育成携带有外源基因的转基因动物,通过分析转基因和实验小鼠表型的关系,研究揭示外源基因的功能,而且可进行工程动物的大量生产。

Gorden等报道了显微注射法用于转基因小鼠的制备。本法是最早,且应用成功率较高的一种转基因方法。其基本步骤如下:

1.同步获得供体雌鼠(注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得)和假孕受体母鼠(正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。

2.供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后,采集清晰的原核受精卵。

3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。

4. 受精卵鉴定 ,将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输

卵管(或子宫)内,饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。

5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。

6. 转基因小鼠品系的建立。

[优点]

(1)外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高;

(2)此法导入外源基因无需载体;

(3)转基因小鼠得率在60%-80%;

(4)导入的外源基因可长达50kb。

[不足之处]

(1)外源基因随机整合;

(2)个别原核不清晰,需进行特殊处理;

(3)需大型精密仪器,费用昂贵;

(4)操作周期相对较长。

(二)实验器材的准备

1.输精管切除术用器材:弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小

夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0丝线及持针器、直径为10cm塑料 Petri氏

培养皿(内盛70%乙醇)。

2.手术前麻醉

2,2,2 三溴乙醇(阿佛丁)是相当有效的麻醉剂。因该试剂对光敏感,所以应该于4度避光保存,新试剂用前应进行测试。经腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后,为了使麻醉剂尽快发生作用,将小鼠放回原笼熟悉的环境中,小鼠将会更容易松驰下来。 挤压小鼠脚垫,如果小鼠能感觉到此刺激,小鼠将从挤压部位开始缩腿运动(pedal reflex),用此方法可以检察是否麻醉完全。实验中小鼠无缩腿运动、小鼠达到手术所需的麻醉深度以及程度方可开始手术。

三溴乙醇的反复使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎症反应。其他麻醉剂中,克他命/甲苯噻嗪在兽医界广泛应用,另外,克他命/美托咪定也越来越受到青睐,特别是在美国。我国一些实验室用戊巴比妥钠的效果好,特别是尾静脉注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥钠0.3ml左右。

3.受精卵的采集用器材:70%乙醇、手术剪、10mL解剖剪、手术镊、M2溶液(Sigma)、小玻璃皿等。

4.离体输卵管中受精卵收集用器材:二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5号镊子、

无菌30-mm组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16溶液(Sigma)、3ml注射器等。

5.DNA显微注射用器材

(1) 受精卵的收集与移动用器材:巴氏移液管、酒精灯、特制吸管、玻璃刀等。

(2) 凹玻片准备:一块标准的凹型载玻片(硅化)、矿物油(Sigma)、工作液等。

(3) 注射设备的设置:微型水力驱动设备、Hamilton Gas-Tite™注射器(250 l)、

Intramedic™管道系统(外径1.27mm,内径0.86mm)、两只玻璃管道连接头、三通管连接器、一只带接头的60ml塑料注射器、一只器械套管、矿物油等。

(4)受精卵的显微注射用器材:凹玻片(显微注射用)、倒置立体相差显微镜

或倒置Nomarski立体光学显微镜、显微操纵器、千分尺(连接添满矿物油,且耐气构造的250l汉密尔顿注射器)、气压装置(50ml充满气体的注射器) 、持卵管、预载DNA的注射针等。

6.输卵管转移的准备

(1) 手术试剂器材:麻醉剂(阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪)、70%乙醇、一副钝性齿镊、两副5号精细镊子、一副10cm手术剪、带自动小夹的金属大剪、一个小弹簧夹、外科缝线、解剖显微镜、纤维光学照明器、载针头的1ml注射器、kimwipe绵纸或外科纱布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手动移卵管等。所有的手术器械在使用前应该彻底清洗,70%乙醇消毒或高热灭菌处理。

(2)受体母鼠的准备

输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小,体重在20-25克左右,严禁用低体重以及超重母鼠,若体重较低,其体能不足以维持妊娠,可能导致受精卵的重新吸收;若体重较重,麻醉剂被吸收入脂肪组织,降低麻醉效果,可能使手术困难,而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在,所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血,难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠,注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重,随着体重的增加,它们将表现出不同程度的感觉消失,但它们是优良的哺育母鼠。另外,它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1,它们生命力强并有一定杂合优势。

(3)麻醉剂:阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。

(三)实验操作程序和方法

1.鼠系克隆

(1) 动情期的探测:在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期:

① 动情后期:阴道口无扩张,周围组织为灰白色,阴道口周围无膨大

② 间情期:阴道开口小,周围组织为灰色或蓝色。

③ 动情前期:阴道口逐渐扩张,阴道周围组织由粉红色变为红色。

④ 动情期:阴道周围组织颜色由红色转为粉红色,阴道口背侧唇可见条

纹,阴道口腹侧唇可见肿大,阴道有分泌液外渗。

随机选择动物,任何时间都可能有20%-25%的动物处于动情期。大多鼠科动物的动情期平均持续4-5天,所以对群居性动物的个体进行动情周期的同步化处理后可能在任一时期产生大量发情动物。动情期动物的选择需两个指标:阴道周围组织色泽和组织膨胀的程度。动情期动物阴道组织深粉红色,但并不同于炎症时的色泽。另外,阴道口周围背腹部组织肿胀而有光泽,起初其腹部可见条纹。个别阴道口组织色泽较深,但无膨胀,或阴道口稍微扩大且略带灰色者为非动情期动物,切勿误选它们用于交配。

(2)交配的确认:阴栓形成。动物合笼后,确定雄性个体是否与母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在阴道内凝固成柔软栓性物,成功交配后不久有阴道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根处,使小鼠头部向下,仔细观察阴道口部位,交配过的雌性小鼠可见有白色橡皮擦状的阴道栓,易肉眼所见,难以确定时可用小探针检查阴道深部是否有栓子存在。检查阴栓应在每天早上的早些时间,因为随着时间的推移,阴栓将被排出体外。

2.输精管切除术:输精管切除小鼠用于与晶胚转移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周龄进行输精管切除术,CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的实验对象。阿佛丁腹腔注射麻醉剂量为240mg/kg。

(1) 称重后麻醉小鼠,背位固定小鼠,大剪刀贴近皮肤剪毛,70%的乙醇涂 搽消毒手术切口部位,以防止毛发污染切口。

(2) 于生殖器前方大约1.3cm处横行剪开下腹部皮肤,作约1cm的切口,

用浸70%乙醇的纱布搽拭切口部位以清理毛发。

(3) 切开腹膜,进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行,用镊子轻轻夹

持左侧管道,提起部分使手术视野清晰可见,确定其为输精管。

(4) 将镊子插进输精管下方,使它们处于自然状态,其末端垂直。同时在该

位置两端用缝线结扎输精管,距离大约4-5毫米。在两结扎点间剪断输精管,置其于纱布上确定此侧手术完毕。

(5) 将输精管两个断端轻轻放回腹腔,如上处理右侧输精管。两侧手术完毕

后,2-3根单独缝线缝合腹壁切口。待用缝线须浸泡在70%乙醇中,保持缝线湿润,防止结扎时粘附组织。用两个或三个自动小夹夹闭皮肤。

(6) 为保暖包裹小鼠于纱布中或将其放置于热垫内使其苏醒,处于麻醉状态

下的小鼠应该严格监护直到其完全苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。

(7) 实验性饲养:将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养,次晨进行阴道栓检查。有阴道栓的母鼠,用磷酸缓冲液处理后24小时,其输卵管潮红。卵细胞应该处于单细胞期或未受孕状态,若处于双细胞期,则输精管切除未完全,雄性小鼠应进行再筛选。

3.受精卵的收集

(1)受精卵的采集:受精卵获得的方法分自然排卵和激素诱发排卵以及体外受精三种方法。本章对诱发排卵法给予介绍。

诱发排卵法:雌性小鼠生后6—8周达到性成熟,性周期均为4—5 日,其排卵时间可用饲养室的明亮和黑暗进行调节,所以必须对饲养室的明暗规律进行准确严格地管理。

性周期是卵泡刺激素和黄体生成素相互作用的结果,我们可以从外部给予这些激素诱发排卵。向成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后,约在48—54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内,约12h后即可诱发排卵。排卵数量可达自然排卵的2倍,效果很好。雌小鼠给予hCG后应立刻与雄性合笼。成熟雄小鼠应按每笼饲养1只,雄性小鼠大小在12周龄到1年。合笼时,须将激素化雌性小鼠放进雄小鼠的笼中。雄小鼠释放促雌性发情的外激素,在交配过程中建议不换笼,交配过的雄小鼠,间隔一周后才进行下次交配。

显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集,此时易进行注射操作。交配后过夜小鼠的阴道栓易见,可用交配指示剂指示。对超排卵的交配母鼠体内进行阴道栓计数一般正常。低比率的有栓母鼠说明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配过度或雄性小鼠老龄化。收获受精卵必须打开小鼠腹腔,输卵管必须仔细切开。输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术都可作为收集受精卵的方法。

(2)腹腔内输卵管的切开

1) 通过断颈或二氧化碳吸入快速处死小鼠。

2) 将动物背位固定在无菌干燥的吸水纸上,剪毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。以避免毛发污染手术视野。

3) 持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤,用外科剪作小的横切口,剪刀钝性分离充分暴露手术视野,或钝性撕开皮肤暴露腹膜。用眼科剪打开腹膜,充分暴露腹腔与子宫角部手术视野。子宫为Y形,为起自盆腔膀胱后的肌性器官,向上分支为两侧子宫角,向上横行深入腹腔。

4) 用镊子距输卵管卵巢6-7mm处夹持子宫角翻转后轻轻拖出腹腔,在镊子捏点下部子宫角下方附近刺破肠系膜,清除肠系膜组织远离子宫角与输卵管,并防止用力过大压破子宫角与输卵管连接处。

5) 用镊子拖出脂肪垫,卵巢,输卵管以及子宫部件。小心剪掉卵巢与输卵管之间的薄层膜,然后剪下输卵管和部分子宫角,将其盛放在盛工作液的小玻璃皿中,对另一侧输卵管重复上面操作,完毕后如上处理下一只动物。

(3)离体输卵管内受精卵的收集:解剖镜下观察近输卵管漏斗部上部明显潮红此为壶腹部。用眼科镊子撕开膨大的壶腹部即看到包绕受精卵的丘细胞团。

1)转移输卵管于含工作液的小玻璃皿中。

2)眼科镊子夹持壶腹部,并用另一只眼科镊子撕开膨大的输卵管,游离的受精卵慢慢流出,也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。

(4)透明质酸酶处理与受精卵的漂洗

工作液中受精卵可能成团状,微注射用的受精卵必须是单个细胞,而且无细胞碎片。漂洗细胞时,首先用工作液除去细胞碎片。不成团细胞可用无菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中,注意把握移液管的张力。溶解在工作液中的透明质酸酶对细胞团以及复合体进行消化时必须严密观察,一旦细胞团溶解立即将单细胞转移到新鲜工作液中,防止消化过度。

用工作液漂洗2-3次,清除碎片后,用无菌移液管将受精卵置于特殊培养基(M16),放于37C, 5% CO2孵箱中待注射,此培养基上层覆盖高压消毒矿物油,可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH。受精卵在体外发育较体内快,在孵育过程中注意观察一些受精卵清晰可见原核形成,在此期间可先选出原核清晰的卵(形态稍不规则)用于注射,其它卵继续培养。注射后,再筛选,再注射,直至得到满意的注射卵数。

4.显微注射

(1)导入DNA的制备:显微注射首先涉及导入DNA的制备,显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA,转基因所用载体是真核表达载体,即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠,必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA,对导入基因的大小没有特别的限制,长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针,如琼脂糖颗粒、纤维物质等,需尽量超速离心除去。

DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml,当DNA注射浓度超过一定上限时,实验效果不佳,而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。

导入DNA的制备程序如下:

1) 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA,用5mg/ml溴乙啶染色。

2) 为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏,用长波紫外光显影。

3) 切下目的基因所在凝胶片,电泳制备目的DNA,或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。

4) 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠,混匀,再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。

5) -200C 孵育过夜后,超速离心机10000转/分,离心5分,收集沉淀,重悬沉淀于Elutip缓冲液。

6) 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。

7) 按照步骤4重新沉淀DNA,用70%乙醇漂洗沉淀2-3次,真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要,因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。

8) 注射缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5)重悬沉淀,缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制

9) 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度

10) 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/l.

(2) 器械准备

[注射针的制作]

注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管,它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪(SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书)可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外,应该对拉针仪的设置进行选择,使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。

[持卵管制作]

为避免机械损伤,持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限,使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损,而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑,平整及与其长轴垂直。具体制备操作:双手执毛细玻璃管的两端,将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰,同时双手外伸,将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开,在镜下观察切口应平齐(如不平齐,应重新切割)。

然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧,然后于显微镜下检查管口形状,如此反复,直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪,则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状,及时调整二者之间的相对位置,更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整,用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃,显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作,持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲(15度)。

[洗卵管制作]

1) 点燃酒精灯,调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。

2) 当吸管开始变软,快速撤离火焰,向外急剧扯拉使吸管变长,形成口径大约200l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度,尽量保证制备吸管的一致性。

3) 为吸管评分,轻柔地折断吸管,辨别其声音是否清脆,或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。

4) 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管,并对其进行调整,确定其口径以及管口光滑平整。

[移卵管的制作]

用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是,这些吸管的口径稍微小一些,大约150m(150-160m),直径比单受精卵的口径略大一些,将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤,同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长,防止融化堵塞。管口要平且要钝化。

[凹玻片的准备]

必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽,也可用培养皿做注射槽,载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中,如M2溶液,使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下:

1) 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面,液滴的液面要水平平整,避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上,矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜,将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上,在低倍镜下调节焦距,使M2溶液液滴的底面清楚为止。

2) 覆盖矿物油的作用:防止液滴脱水以及浓缩;使受精卵处于无菌状态;

固定M2溶液液滴。

3) 从孵箱中取出受精卵,用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次,调整实验用量,将其置于凹玻片的M2溶液中,调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓,并且保证受精卵有足够空间自由移动,用持卵器将卵汇聚到一起,移卵时注意不要将气泡移入,影响操作视野。

[显微注射设备]

显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测,显微镜两侧各置一台显微操作仪,一侧接持卵管,另一侧接注射针,可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器,通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后,进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统(major instruments.co.Ltd)等,具体操作程序按其说明书严格进行。

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