幽门螺杆菌小鼠模型的建立及检测

【实验目的】 <o:p></o:p>

１． 学习幽门螺杆菌小鼠模型的建立方法。 <o:p></o:p>

２． 掌握细菌染色——Warthin-Starry硝酸银染色方法。 <o:p></o:p>

３． 了解荧光定量PCR检测原理。 <o:p></o:p>

【实验原理】 <o:p></o:p>

胃细菌学的研究，长期以来是一个被忽视的领域。1983年Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者胃黏膜活检标本中分离到幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp），是对这一领域重要的突破，它的发现对消化病学、特别是胃十二指肠病学的发展起了极大的推动作用。现在已经清楚幽门螺杆菌是许多慢性胃病（慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等）发生发展中一个重要致病因子，已被WHO列入第一级致癌物质。因此，准确检测Hp对防治胃炎、消化性溃疡有重要意义。本实验在建立幽门螺杆菌小鼠模型的基础上，采用快速尿素酶测定(RUT) 试验、Warthin-Starry硝酸银染色和荧光定量PCR法3种手段检测小鼠感染幽门螺杆菌的情况。 <o:p></o:p>

【实验对象】 <o:p></o:p>

昆明小鼠40只（雄性，3周龄，体重16～18 g）。动物饲养控制条件为清洁级。 <o:p></o:p>

【实验试剂与器材】 <o:p></o:p>

1. 器材　荧光定量PCR仪，微需氧袋。 <o:p></o:p>

2. 试剂　幽门螺杆菌菌株NCTC 11637，布氏肉汤培养基（Brucella Broth），2％尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液。幽门螺杆菌荧光定量PCR试剂盒。 <o:p></o:p>

醋酸缓冲液(pH3.6)： <o:p></o:p>

无水醋酸钠 1.64 g <o:p></o:p>

醋酸 2.5 ml <o:p></o:p>

蒸馏水 200 ml <o:p></o:p>

1%硝酸银溶液： <o:p></o:p>

硝酸银 0.5 g <o:p></o:p>

醋酸缓冲液 50 ml <o:p></o:p>

2%对苯二酚溶液： <o:p></o:p>

1，4-对苯二酚 200 mg <o:p></o:p>

醋酸缓冲液 10 ml <o:p></o:p>

2%明胶溶液： <o:p></o:p>

明胶 1 g <o:p></o:p>

醋酸缓冲液 50 ml <o:p></o:p>

加温溶解 <o:p></o:p>

显色液： <o:p></o:p>

2%明胶溶液 20 ml <o:p></o:p>

2%对苯二酚溶液 3.5 ml <o:p></o:p>

1%硝酸银溶液 1.5 ml <o:p></o:p>

显色前混合 <o:p></o:p>

【实验方法与步骤】 <o:p></o:p>

1. Hp的培养　把幽门螺杆菌NCTC 11637接种到布氏肉汤培养基上，迅速放入微需氧袋，35℃，培养72 h。 <o:p></o:p>

2. 分组与处理　采用分组设计，应用随机数字表将40只小鼠分成实验组和对照组(各20只)。 <o:p></o:p>

3. 幽门螺杆菌小鼠模型的建立　实验组每只小鼠灌喂Hp菌液200μl(含菌5×108 CFU)间隔2 d，共感染3次。所有动物灌喂处理前禁食24 h，禁饮水4 h，灌喂后继续禁食、水4 h。对照组灌喂等量布氏肉汤培养基。 <o:p></o:p>

4. 解剖　距末次灌喂菌液8周后，脱臼处死，剖腹采集食道、胃、小肠、结肠和直肠组织，进行下述检测。 <o:p></o:p>

【观察项目】 <o:p></o:p>

1. 快速尿素酶测定(RUT) 试验 <o:p></o:p>

无菌2％尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液各3滴滴于标本上，37℃温育30 min，变红色者为阳性。 <o:p></o:p>

2. 病理组织学检查 <o:p></o:p>

组织块用4％甲醛固定，制作石蜡切片作Warthin-Starry硝酸银染色。 <o:p></o:p>

Warthin-Starry硝酸银染色法操作步骤： <o:p></o:p>

①切片脱蜡至水。 <o:p></o:p>

②醋酸盐缓冲液冲洗切片2次，1min/次。 <o:p></o:p>

③加入1%硝酸银水溶液（预热达60℃）处理切片60 min，在烤箱中进行。 <o:p></o:p>

④于显影液中（60℃烤箱）3 min，镜下控制，如果没达到要求，还可继续延长时间，直到合适为止。 <o:p></o:p>

⑤ 取出切片，用60℃热水洗切片。 <o:p></o:p>

⑥醋酸盐缓冲液冲洗切片2次，1min/次。 <o:p></o:p>

⑦脱水，透明，封片。 <o:p></o:p>

3. 荧光定量PCR法检测 <o:p></o:p>

选用幽门螺杆菌NCTC 11637特异性的引物和探针进行扩增杂交，操作按试剂盒说明书进行；采用空肠弯曲菌、解尿支原体作为对照菌进行荧光定量PCR。 <o:p></o:p>

【注意事项】 <o:p></o:p>

1. 配制和使用硝酸银溶液时要格外小心，不要滴洒在地上，桌上及手上等处，氧化为黑色的液点极难去除。 <o:p></o:p>

2. 荧光定量PCR操作时要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 <o:p></o:p>

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　思 考 题 <o:p></o:p>

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简述荧光定量PCR的基本原理。 <o:p></o:p>

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（曲　萍）