幽门螺杆菌小鼠模型的建立及检测

【实验目的】

１． 学习幽门螺杆菌小鼠模型的建立方法。

２． 掌握细菌染色——Warthin-Starry硝酸银染色方法。

３． 了解荧光定量PCR检测原理。

【实验原理】

胃细菌学的研究，长期以来是一个被忽视的领域。1983年Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者胃黏膜活检标本中分离到幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp），是对这一领域重要的突破，它的发现对消化病学、特别是胃十二指肠病学的发展起了极大的推动作用。现在已经清楚幽门螺杆菌是许多慢性胃病（慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等）发生发展中一个重要致病因子，已被WHO列入第一级致癌物质。因此，准确检测Hp对防治胃炎、消化性溃疡有重要意义。本实验在建立幽门螺杆菌小鼠模型的基础上，采用快速尿素酶测定(RUT) 试验、Warthin-Starry硝酸银染色和荧光定量PCR法3种手段检测小鼠感染幽门螺杆菌的情况。

【实验对象】

昆明小鼠40只（雄性，3周龄，体重16～18 g）。动物饲养控制条件为清洁级。

【实验试剂与器材】

1. 器材　荧光定量PCR仪，微需氧袋。

2. 试剂　幽门螺杆菌菌株NCTC 11637，布氏肉汤培养基（Brucella Broth），2％尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液。幽门螺杆菌荧光定量PCR试剂盒。

醋酸缓冲液(pH3.6)：

无水醋酸钠          1.64 g

醋酸                2.5 ml

蒸馏水              200 ml

1%硝酸银溶液：

硝酸银              0.5 g

醋酸缓冲液          50 ml

2%对苯二酚溶液：

1，4-对苯二酚       200 mg

醋酸缓冲液          10 ml

2%明胶溶液：

明胶                1 g

醋酸缓冲液          50 ml

加温溶解

显色液：

2%明胶溶液          20 ml

2%对苯二酚溶液      3.5 ml

1%硝酸银溶液        1.5 ml

显色前混合

【实验方法与步骤】

1. Hp的培养　把幽门螺杆菌NCTC 11637接种到布氏肉汤培养基上，迅速放入微需氧袋，35℃，培养72 h。

2. 分组与处理　采用分组设计，应用随机数字表将40只小鼠分成实验组和对照组(各20只)。

3. 幽门螺杆菌小鼠模型的建立　实验组每只小鼠灌喂Hp菌液200μl(含菌5×108 CFU)间隔2 d，共感染3次。所有动物灌喂处理前禁食24 h，禁饮水4 h，灌喂后继续禁食、水4 h。对照组灌喂等量布氏肉汤培养基。

4. 解剖　距末次灌喂菌液8周后，脱臼处死，剖腹采集食道、胃、小肠、结肠和直肠组织，进行下述检测。

【观察项目】

1. 快速尿素酶测定(RUT) 试验

无菌2％尿素水溶液，酚红磷酸缓冲液各3滴滴于标本上，37℃温育30 min，变红色者为阳性。

2. 病理组织学检查

组织块用4％甲醛固定，制作石蜡切片作Warthin-Starry硝酸银染色。

Warthin-Starry硝酸银染色法操作步骤：

①切片脱蜡至水。

②醋酸盐缓冲液冲洗切片2次，1min/次。

③加入1%硝酸银水溶液（预热达60℃）处理切片60 min，在烤箱中进行。

④于显影液中（60℃烤箱）3 min，镜下控制，如果没达到要求，还可继续延长时间，直到合适为止。

⑤ 取出切片，用60℃热水洗切片。

⑥醋酸盐缓冲液冲洗切片2次，1min/次。

⑦脱水，透明，封片。

3. 荧光定量PCR法检测

选用幽门螺杆菌NCTC 11637特异性的引物和探针进行扩增杂交，操作按试剂盒说明书进行；采用空肠弯曲菌、解尿支原体作为对照菌进行荧光定量PCR。

【注意事项】

1. 配制和使用硝酸银溶液时要格外小心，不要滴洒在地上，桌上及手上等处，氧化为黑色的液点极难去除。

2. 荧光定量PCR操作时要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

 

 

　思 考 题

 

简述荧光定量PCR的基本原理。

 

（曲　萍）