利 什 曼 原 虫 感 染 的 小 鼠 模 型

基 本 方 案 皮 肤 利 什 曼 原 虫 病 小 鼠 模 型

材 料

寄生虫接种物，无鞭毛体或后发育期前鞭毛体（见辅助方案 1〜3)

D M E M 或 H B S S (附录 1)，不加CaCl2或MgCl2

小 鼠

1 9 9 完 全 培 养 基（C-M199)

测 径 器（游标 ，标度盘或数字的）

1.5 ml Eppendorf 离 心 管（高压灭菌，提前称重）

1.5m l 微量离心管研磨棒（聚丙烯，一次性，灭菌）

血 液 琼 脂 培 养 皿（见辅助方案 4)

26°C ，无 C O 2 培养箱

1 . 将 寄 生 虫 接 种 物 溶 解 于 D M E M 或 H B S S 中，配 成 所 需 浓 度（IO⁵ 〜 IO⁷) 至40 〜 50ul。

除 了 遗 传 背 景 外 ， 小 鼠 模 型 的 疾 病 过 程 及 结 果 可 受 寄 生 虫 剂 量 、 接 种 途 径 及 部位 、 寄 生 虫 致 病 力 的 种 内 差 异 等 影 响 。 需 用 特 定 期 的 寄 生 虫 感 染 ， 以 比 较 体 内 致病 力 。

2 . 浅 麻 醉（附 录 2D ) 或 将 小 鼠 固 定（附录 2C ) 后 ，足垫注射含有寄生虫的悬液（附录2E )。

3.每周或定时观察足垫肿胀情况。固 定 动 物（不麻醉），用测径器在第五趾尖底部测量足垫宽度和厚度，以未接种足垫作为对照。结果为足垫厚度、宽 度 的 增 加 值（或评分），以 m m 2 表示。

4a.淋巴结或脾脏：接种侧腹股沟引流淋巴结或脾脏制作成单细胞悬液后（单 元 2.1)重 悬 于 10m l C -M 1 9 9 中。

4b.足垫：表面消毒感 染 足 垫 后 解 剖（见 辅 助 方 案 2)，取 下 1〜IOmg 组织放入灭菌、提前称重的含有〇• 3 ml C -M 199 的 Eppendorf 管 内 ，盖上盖子后翻转或轻敲管子使组织沉于底部，不使组织脱水。称重离心管后研磨组织。避 免 手 术 刀 或 剪 刀 同 组 织 一 起 浸 入 培 养 基 ， 这 样 会 带 走 一 定 体 积 的 溶 液 ， 造 成组 织 称 重 不 准 确 。

5.取 IOOmI 组 织 勻 浆（或脾脏或淋巴结悬液）和 相 同 体 积 的 C-M 1 9 9 , 进行倍比稀释，接种至灭菌的血液琼脂培养板中。密封培养皿， 26°C ，无 CO2 条件下培养 7〜 10d。倍 比 稀 释 可 在 9 6 孔 板 上 进 行 ， 然 后 转 移 至 适 当 的 血 液 琼 脂 培 养 皿 内 。

6 . 倒置显微镜下计数前鞭毛体。如果血琼脂板影响直接观察，可取少量液体于载玻片或 9 6 孔板上进行计数。计算整个淋巴结或脾脏寄生虫数量，也可计算每毫克足垫组织的寄生虫数量，即寄生虫可生长的最高稀释度/组织重量。

辅 助 方 案 1 使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体

后发育期的前鞭毛体体外生长在种系之间明显不同，即使在同一品系内，也可受传代培养的次数及生长条件的影响。因此，动物感染所需的前鞭毛体接种物应尽可能通过纯化后发育期前鞭毛体而标准化。在 L .mai 〇 r 和 L .d o n o m n f 的固定培养物中，由于后发育期前鞭毛体不被花生凝集素凝集，因此可用于鉴别和纯化后发育期前鞭毛体。

材 料

寄生虫：新 鲜 分 离 或 冷 藏 的 或 L • 而 定 的 无 鞭 毛 体（见辅助方案2 和 3 ) 或早期前 鞭 毛 体（A T C C ; 见辅助方案 3)

199 完 全 培 养 基（C -M 199)

D M E M 或 H B S S (附录 1)，不加 CaCl2或 MgCl2

5〜10 mg/ml花生凝集素（PNA;Vector Lab 公司）

25c m 2 组织培养皿

75c m 2 或 225c m 2 组 织 培 养 皿（任选）

26° C ，无 C O 2 培养箱

1 . 在 25 cm2 培养瓶中加入 IOml 的 C-M 199，接 种 0.5X 10⁷〜I X l O ⁷ 寄生虫， 26°C ，培
养 6d

2 . 可选：根据所需后发育期寄生虫的数量，将 上 述 I O m l 已处于对数生长的寄生虫接种到 含 50〜IOOml C-M 199 的 75 cm2 或 225c m 2 组织培养瓶中，扩增培养 1〜2d。

3 . 在装有 50ml DMEM 或 HBSS的 50ml 离心管中 4℃， 3000g离心 15min，洗涤两次。重 悬 于 D M E M 或 H B S S 中并计数，加 少 量 2 0 % (V/V ) 丙三醇用于保存活力，配成 I X l O⁸〜2 X IO⁸ 个细胞/m l 。

4 . 加 0. O l 体 积 的 5 〜10m g /m l 花 生 凝 集 素（终 浓 度 5 0〜 100]ug/m l) 。 室 温 培 养 15〜30m in。 4°C ， 200 g 离 心 5m in。 收集上清后按步骤 3 洗涤两次。

5 . 以少量体积 D M E M 或 H B S S 重悬细胞，计数后配成合适浓度以供培养。

辅 助 方 案 2 从足垫组织中纯化无鞭毛体

为了避免前鞭毛体异质性的问题，可以通过接种从感染组织中纯化的无鞭毛体组分。

材料

B A L B /c 小鼠 ，足垫无溃疡性损伤（见基本方案）

1,75% (V /V ) 碘 溶 液（碘附， A m s c o )

7 0 % (v/ V ) 乙醇

PBS (附录 1 ) 包含 2 mmol/L E D T A 和 50 mmol/L 葡萄糖

D M E M 培养基或 H B S S (附录 1)，不加〇 3(312 或 MgCl2
5m g /m l 二 乙 酸 荧 光 素（F D A ; Sigma) 丙 酮 液（4°C 稳 定 6 个月）

20ug/m l 碘 化 丙 啶（PI; Sigma) P B S 液（4°C 稳 定 6 个月）

研钵

灭菌的玻璃纤维

1 . 感 染 后 4〜6 周 ，在形成溃疡前，脱颈处死 B A L B /c 小鼠。表面消毒足垫，浸泡足垫于 1 . 7 5 % 碘 溶 液 lOm in， 然后浸泡足垫于 7 0 % 乙 醇 IOmin，蒸馏水清洗。

从 感 染 了 表 皮 种 属 的 无 鞭 毛 体 包 括 L .m a jo r 、 L . m exica n a 、L ,am azonensis 某些种类的 L . 的 B A L B /c 小鼠的一个足垫可收集 到 大 量 的 无 鞭 毛 体（近10⁸)

2 . 分离皮肤和皮下损伤组织，用无菌手术刀或剪刀切除主要损伤组织。

3 . 在 盛 有 小 量（3〜5 ml) 含 2 mmol/L E D T A 和 50 mmol/L 葡 萄 糖 的 P B S 的研钵中轻轻研磨感染组织。在显微镜下观察组织匀浆是否大多数宿主细胞破裂。

4 . 用装有少量无菌玻璃尼绒毛的 5m l 注射器过滤所得悬液。

5.4°C ， 200 g 离 心 IOmin 去除细胞碎片。重 悬 无 鞭 毛 体 于 50 ml D M E M 或 H B S S 中，4°C ， 3000 g离心 15m i n 后 ，沉淀物用少量 D M E M 或 H B S S (1〜5 ml) 重悬。

6.将 5m g /m l 的 F D A 液 0 •04m l 加 入 到 I O m l 的 P B S 中，制 备 新 鲜 F D A 工 作 液 。将0 . 1ml FDA 工 作 液（最 终 2 ug ) 和 0 . 0 3ml 的 2 0 ug /ml 的 PI( 0 . 6 ug ) 直 接 加 至0.1〜1. O m l 细胞中。细 胞 染 色 3m i n 后置于白细胞计数器中。用倒置荧光显微镜检测 ，交 替 使 用 绿 色（可见光）和 红 色（不可见光）过滤片观察和计数标记细胞。

7 . 调整浓度用于接种或冷冻保存（见辅助方案 3)。

辅 助 方 案 3 前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏

材 料

对数生长的利什曼原虫前鞭毛体培养物（A T C C ; 见 辅 助 方 案 1 ，步 骤 1〜2)，或新鲜分离制备的前鞭毛体（见辅助方案 2)

RPMI1640 培养基， 4℃和 37℃。

2 X 冷冻保存液

7 0 % (V / V ) 乙醇

C-Ml 99

冷 冻 容 器（如 Nalgene M r .Frosty or microprocessor controlled) ， 容器外层装有异丙醇预冷

75 cm2 灭菌组织培养瓶

1 . 制备新鲜分离 的 无 鞭 毛 体（5 X IO⁷ 溶 于 冷 R P M I ; 见 辅 助 方 案 2 ) 或 经 辅 助 方 案 1(步骤 1〜2 ) 培养的新鲜无鞭毛体培养物。收 集 对 数 生 长（培 养 2〜3d) 的前鞭毛体
培养物， 4°C ， 1500 g 离 心 10 min，去 上 清 ，振动管子轻轻打碎细胞沉淀后加入冷R P M I 配 成 5 X IO⁷ 个细胞/m l 的浓度。

2 . 以滴入方式加入等体积的 2 X 冷冻保存培养基。取 I m l 悬液加入预先标记的冷冻管中，置 冰 上 15 min。将冷冻管转移到预冷的容器中 ， 一 70°C 冰箱放置过夜后，将冷冻的寄生虫冷冻管放置液氮中保存。

3 . 复苏时，从液氮中取出冷冻管，立 即 放 入 37°C 水 浴 ，轻轻振荡至完全融化， 7 0 % 乙醇擦拭小管表面。

4 . 将寄生虫悬液加入灭菌的 15m l 聚丙烯离心管中，加 入 I O m l 温 R P M I (37°C ) ，以滴入方式轻轻混匀。 4°C 或室温， 3000 g 离 心 15 min，弃上清。

5 . 轻敲小管，重悬寄生虫于 10 ml C -M 1 9 9 , 加 入 75 cm2 培养瓶中培养。解冻的无鞭毛体经过活力检测，也可直接用于感染动物（见辅助方案 2)。

辅 助 方 案 4 血琼脂培养板的制备

材 料
兔血，去 纤 维 蛋 白（Rocklandlmmunochemicals)

N N N 培 养 基（三 N 培养基：诺-尼-麦三氏细菌培养基，含琼脂、盐 、兔血 ，用以培养黑热病病原体—译者注）

3〜5m m 玻 璃 珠（Thomas)

43°C 水浴

9 6 孔平底培养板，灭菌 ，带盖

1 . 微波炉液化 70 ml N N N 培养基，在水浴中降温到 43°C ; 取 30m l 预 温 43°C 的去纤维蛋白兔血与 N N N 培养基混合。

2.将 9 6 孔板置于倾斜 70°〜80°位置，加入混合液 50ul /孔 ，盖上盖子， pamfilm 膜封口或放于加湿盒中。用 前 4°C 可 保存 6〜8 周 。