🔥 细胞毒性分析（CCK-8 法）

细胞毒性是指由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 常用细胞毒性检测方法有 CCK-8 法、MTT 法、LDH 法。

1、与 MTT 法相比：

1）CCK-8 使用更为方便，无需洗涤细胞；
2）CCK-8 法能快速检测；CCK-8 法的检测线性范围广，灵敏度更高；
4）CCK-8 法的重复性更好，MTT 实验生成的 formazan 不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解；CCK-8 法产生的formazan 是水溶性的，既省去了溶解步骤，又可以减少该操作步骤带来的误差；
5）CCK-8 法对细胞毒性小，可以保持细胞原状态；CCK-8 法试剂价格较高；

2、与 LDH 法相比：

1）CCK-8 是加在细胞中，而 LDH 检测是细胞上清，这样细胞还可以用来做其他实验；
2）LDH 法可进行高通量检测；

以 CCK-8 法为例简述其原理：CCK-8 试剂盒中含水溶性四唑盐WST-8 (化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的条件下，活细胞线粒体中的脱氢酶催化 WST-8 生成高度水溶性的橙黄色甲瓒燃料，而甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系。

1、药物筛选实验；
2、肿瘤药敏试验；
3、生物活性因子的活性检测；
4、细胞增殖测定等；

【材料】细胞悬液，化合物溶液、CCK-8 试剂、完全培养基、PBS、0.25% Trypsin-EDTA

【仪器，耗材】96 孔板，二氧化碳培养箱，检测波长 450-490nm酶标仪

1、根据具体细胞类型确定其在 96 孔板种植密度，以对照组细胞密度至检测时达到 70%-90% 为参照，每组设置 3-6 个复孔，孔板边缘空不用，加入与培养基等体积的无菌 PBS 溶液；

2. 每孔加入培养基体积 1/10 的CCK-8 溶液。若起始的培养体积为 200 微升，则需加入 20 微升 CCK-8 溶液，其它情况以此类推。同时以加了相同体积细胞培养液和 CCK-8 溶液但没有细胞的孔作为空白对照。若所用药物会干扰检测结果，则选加入等体积细胞培养液、药物和 CCK-8 溶液但无细胞的孔作为空白对照（注意不可产生气泡）；

3. 在细胞培养箱内继续孵育 2-4 小时，建议选取 2、3、4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验；

4. 在 450 nm 测定吸光度。如无 450 nm 滤光片，可以使用 420-480 nm 的滤光片。可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定。

1、本实验使用 96 孔板进行检测，周围一圈最容易蒸发，检测会因体积不准确而增加误差故弃用周围一圈，加入等体积相同量的PBS、水或培养液；

2、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，因而还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定；

4、酚红和血清对 CCK-8 法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

5、试剂有一定的毒性，请穿好实验服并戴一次性手套操作；

6、试剂要注意避光 4℃ 或 -20℃ 保存；

1. 如果细胞生长较慢，且细胞较小，可以最大接种 1x10^{^4} cells/well，但加入化合物后处理时间最长为 72 h。

2. 化合物如果难溶于水，可以在培养基中适当添加 DMSO、DMF 以助溶，但最大浓度不宜超过 0.5%，因为 DMSO 和 DMF 对细胞也有一定的毒性。如果使用 DMSO、DMF 助溶，需保证其他浓度的化合物 DMSO、DMF 的浓度也相同。

3.若吸光度值太低，怎么办法？
1）适当增加细胞数量；
2）延长加入 CCK-8 溶液后的孵育时间。