细胞增殖和细胞毒性（CCK-8法）原理和经验总结

一、实验原理

细胞活力检测试剂盒(CCK-8) 可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。

二、用途

药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

三、优点

• 使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
• CCK-8法能快速检测；
• CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
• CCK-8法的重复性优于MTT 法，产生的formazan 是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差；
• CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
• CCK-8细胞活性检测试剂无需预制，即开即用。

四、实验操作指南

1．96孔板每孔加入细胞100 μL（留2个空白组不加细胞，加入同体积的培养基）。细胞置于37°C的5%CO₂细胞培养箱中培养24 h。

注：A、通常细胞增殖实验每孔加入100 μL约含2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100 μL约含5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。

B、培养温度与细胞类型有关，一般哺乳动物细胞建议37°C，其他种属根据细胞培养条件选择合适的温度。

2．每孔加入10 μL不同浓度的药物刺激激（1 中加了细胞的，留 2 个对照组不加药物，加 入同体积的培养基）。

3．将96孔板在37°C，含5% CO₂空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

注：同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

4．每孔加入10 μL的CCK-8溶液。37°C，5%CO₂培养箱中孵育1~4 h。

注：同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

5．酶标仪测定450 nm处的吸光度。

6．如果暂时不测定OD值，可向每孔中加入10 μL 0.1 M HCl溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

7．结果分析：

A．细胞存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值（空白组），各重复孔的OD值取平均数±SD。

细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。

B．求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC₅₀)及T/C = 10%时的药物浓度(IC₉₀)。

五、经验总结

1．种板数：通过文献确认，看实验所用细胞别人是否做过，找出大致范围。稀释一系列浓度种板。

观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。在实验时间内，观察不同细胞数下孔内生长情况。在拟定的时间内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？

因为每块板都需设置对照孔，也就是含有细胞的培养基中加入CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近。不要让细胞长满，其一，会对药物顺利进入细胞产生影响此，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大。

2．贴壁生长的时间一般设置贴壁24h，这个时间一般细胞已经贴壁完全，且对安排实验时间也方便。

3．加药后的孵育时间，设置时间梯度，根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。

4．接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种数孔即混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或无菌PBS，而不作为指标检测孔。

5．CCK8试剂加入量，按照说明书的体系加入合适的CCK-8的含量如细胞体系较大，适当增加CCK-8的量。

6．CCk8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。第一次做实验时，建议先做数孔摸索接种细胞的最佳数量和加入CCK-8试剂后的最佳孵育时间。一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量 (～10⁵个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK- 8孵育1- 4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK- 8最佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK- 8的孵育时间一般为1- 4小时，多数细胞在培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5-4小时左右检测效果最佳。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。

7．实验时尽量多设置复孔，取平均值。实验时把OD值控制在1.0左右。因人为造成的数据不稳定只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。另外实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。

8．CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。

9．如何判定待测溶液是否有还原性？不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1-4小时，测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待检测体系中存在较少的还原剂，正式检测时即可直接加入CCK-8 ；如果该吸光度相对较大，说明待检测体系中存在较多的还原剂，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10 μL CCK-8进行检测。

10．如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600 nm (或600 nm以上) 作为参比波长，扣除参比波长的O.D值即可。