多年 CCK-8 经验总结请收好，这些坑不要再跳了

在细胞培养实验过程中，大家是不是总会好奇别人家的实验总是做的又快又好，而自己做的实验又慢又难得做出自己满意的结果，搞得一天到晚也挺忙的，心想：我也很努力很认真啊，为啥效率总提不起来呢？

其实，有时候并不是自己不努力，只是没有找对方法。做实验可不能光是埋头苦干，还要学会运用合适的检测试剂盒，这样就能事半功倍。

如果你还在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小时才能得到的结果用 CCK-8 只需 1 小时，CCK-8 可用于细胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即开即用，检测时间大概在 1 小时左右。

不仅如此，CCK-8 对细胞的毒性极小，完全可以测完细胞增殖或药物毒性后再继续用细胞进行下游实验。下面小编就来为大家介绍一下 CCK-8 的具体情况。

基本原理为：该试剂中含有 WST-8【化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2 H-四唑单钠盐】，它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan dye）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

主要用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

☆实验一：细胞活性检测

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待测细胞调密度至 （1,000~10,000）/ 孔。

2. 5% CO2，37℃ 培养细胞 24 小时（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）。

3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培养体积为 200 μL，则需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情况以此类推。

4. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时，对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定（一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的 CCK-8 反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞，CCK-8 的培养时间一般为 1~4 小时，注意：CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准）。初次实验时可以在 0.5、1、2 和 4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

5. 在 450 nm 测定吸光度。

☆ 实验二： 细胞增殖 - 毒性检测

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待测细胞调密度至 （1,000~10,000）/ 孔。

2. 5% CO2，37℃ 培养细胞 24 小时（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）。

3. 加入 10 μL 不同浓度的待测物质，将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 （例如 6、12、24 或 48 小时）。

4. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培养体积为 200 μL，则需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情况以此类推。

5. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时，对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定（一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的 CCK-8 反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞，CCK-8 的培养时间一般为 1~4 小时，注意：CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准）。初次实验时可以在 0.5、1、2 和 4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 在 450 nm 测定吸光度。

☆ 注意事项：

如果待测物质有氧化还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜的培养基，去掉待测物质的影响。

☆ 计算公式：

• 细胞存活率 = [（实验孔 — 空白孔）/ （对照孔 — 空白孔）] × 100%

• 抑制率 = [（对照孔 — 实验孔） / （对照孔 — 空白孔）] × 100%
  

• 实验孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）

• 对照孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质）

• 空白孔 （不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8）

1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。

3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。

4. 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。

5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。

6. CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。

7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。

8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较 （只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应。

9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。

10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。

答：CCK 稳定性高，避光条件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存，避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。

☆ CCK 会对活细胞进行染色吗？

答：不会，首先 WST-8 不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。

☆在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？

答：一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。

☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢？

答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。

答：可以，CCK-8 产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将 CCK-8 产品稀释一倍，然后加入培养基总体积的 20% 即可，这样可减少误差。

答：可以在 450 nm 波长处测 OD 值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在 430~490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。

答：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化

答：可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。

答：可以采取 2 个办法：1、适当增加细胞数量；2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。

答：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。