人胚胎干细胞系:衍生与培养实验

2.2.5 BRL-条件培养基 B R L 细胞在大鼠肝细胞培养基（BRL-CM) 中生长至汇合，用新鲜培养基更换一次 ， 3 天后收集这些培养基。 所有培养基用无菌的、孔 径 0.2um 的 P E S 滤膜过滤，特别是来自其他细胞类型的条件培养基。应该注意的是：在细胞分化研究中可能被用到的生长因子和其他小分子需要无菌准备，但不能过滤，以免这些物质与滤膜结合而被损耗。

2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞（MEF) 的 制 备 最广泛地用于支持 h E S 的伺养层细胞来自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,， 1998;Reu-binoffetal. ， 2000]，如小鼠胚胎饲养细胞（MEFs) ，尽管它们可能是最原始的间叶细胞的前体细胞。 每一 种 h E S 细胞系在不同的词养层细胞上的生长可能不同，这点

方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 5〜6 天的人胚泡，经 H F E A 允许，并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到（http//:www.hfea.g0v.uk)。 □链霉蛋白酶， 0 . 5 % ，溶 于 DMEM □ 抗 人 抗 体

方 案 2.7 h E S 细 胞 的 手 工 传 代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 新 鲜 的 M E F 板（最好是在失活处理后 1〜3 天内） □ h E S 培 养 基（见 2. 2. 1 节） □ 50 ul加样器枪头 □玻璃巴氏吸管 非无菌

方 案 2. 9 采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 饲养层之上的未分化的 h E S 细胞 □ hES-HEPES 培 养 基（见 2. 2. 2. 1 节） □ 1 0 % 玻 璃 化 溶 液（见 2. 2. 2. 4 节） □ 2 0 % 玻 璃 化 溶 液（见 2

方 案 2. 11 通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 0.1 % 明胶包被的玻璃盖玻片上的h E S 细胞 非无菌 □ 4 % 多聚甲醛 □ P B S A □ T ris-缓 冲 盐 溶 液（T B S 一） □含有 0.5 % T

方 案 2. 14 由 h E S 细 胞 产 生 胚 胎 样 小 体 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F s 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 加样器，设置在 50ul □ 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿（特 殊 包 被 过 的 皿 ，可 防 止 细 胞 附 着 ；见 2.9节） ， 2. 6 cm