材料与仪器
步骤
2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(MEF) 的 制 备
最广泛地用于支持 h E S 的伺养层细胞来自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,, 1998;Reu-binoffetal. , 2000],如小鼠胚胎饲养细胞(MEFs) ,尽管它们可能是最原始的间叶细胞的前体细胞。
每一 种 h E S 细胞系在不同的词养层细胞上的生长可能不同,这点要注意,对于高效率的增殖有些饲养层细胞比另外一些细胞更合适,通常要传 5〜10代以确保细胞适应于新的伺养细胞。始终要做到只要细胞培养标准条件改变,就要对细胞的核型稳定性和多能性进行严格的核查。方 案 2. 1 介绍了原代 M E F 细胞的分离培养。
2.3.1 原代培养
小鼠胚胎饲养细胞能够从妊娠〗15.5 —— 16.5 天 的 小 鼠 胚 胎(E15.5〜E 16.5 ) 中分离出来,培养过程易于生长,是一种可靠的、持 续 的 饲 养 细 胞 的 来 源 ,并能在液氮中维持很长时间。 MEFs 通常是在复苏之后 2〜5 天使用。方 案 2 . 1 是 由 N agy 等人的方 案 修 改 而 来 [2003]
方 案 2.1 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(M E F s) 的 原 代 培 养
试剂与材料
无菌或无菌制备
□ MEFM (见 2. 2. 3)
□ 无 Ca2+ 和 Mg2+ 磷 酸 盐 缓 冲 液(PBSA)
□ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , 用 GIBCO 溶 液 A 配 制(参 见 2. 9 节)
□ 乙 醇 7 0 %
□ 75 cm2 培养瓶
□ l0 cm Petri 培养皿,塑料的,非组织培养级别
□带螺盖的离心管 , 15m l 和 50 ml
□用于解剖的镊子和解剖刀(使用之前高压消毒并保存在 70% 酒 精 中 )
□可更换的解剖刀片, 1 1 号
非无菌
□计时妊娠鼠, 15.5〜16.5 天(经典常用的小鼠品系包括 SV 129 和C 57: BL)
步骤
(a) 处 死 妊 娠 15. 5〜16. 5 天的小鼠。
(b) 用 70 % 酒精擦洗鼠的腹面。
(c) 剪开皮肤和组织暴露子宫。
(d) 取出子宫角并放到含有 P B S A 的 10 cm Petri 塑料皿里。
(e) 用解剖刀从胚囊中取出胚胎,丢弃其他所有的组织包括胎盘以及胎膜。
(f) 取出含有脑组织的头的上部并丢弃。
(g) 沿着从头到尾的中轴从幼崽前端开始切开胚胎进行解剖,暴露及丢弃内部器官。
(h) 把胚胎剩余部分放在 50m l 离心管里用 P B SA 洗 4 遍 。
(i) 把胚胎剩余部分转人干净的 10 cm Petri 皿 中 ,去 掉 PBSA ,把胚胎用新的解剖刀切 成 2 mm 大小的小块。
(j) 把切碎的胚胎放到 15m l 离心管里,加 人 IOml 0 . 2 5 % 的胰蛋白酶,在 37°C 孵育 10〜20 min。
(K) 使小块沉淀下来,从孵育管中取出 5m l 胰蛋白酶以及分散的细胞,并且放到无 菌 的 50m l 的离心管里。
(l) 加人等体积的 M EFM 抑制胰蛋白酶活性。
(m) 再 加 人 5 ml 0. 2 5 % 胰蛋白酶到原先的含有胚胎的 15m l 离心管里,并 在 37°C再 孵 育 10’〜20 min
(n) 重 复 步 骤(k) ,(I), (m ) ,大 约 进 行 5 次孵育,将所有加人的胰蛋白酶以及分散的细胞放人同一个 50m l 离心管。只有没溶解的软骨将被留在原先的含有胚胎的15m l 管中。
(O) 用力地分散胰蛋白酶消化的细胞悬液并允许剩余的小块沉淀。
(P) 取出并保存上清液,去除沉淀。
(q) 离心上清液, l000 g , 5 min
(r) 用 IOml MEFM 重悬沉淀并用台盼蓝计数活细胞数
(s) 每 个 160 cm2 培养瓶接种 5 X IO6 细胞,再 加 人 IOml MEFM。
(t) 在 37°C 、5 % C02 温箱里孵育过夜。
(u) 第二天,用 20m l 的新鲜的 M EFM 培养基置换旧的培养基以去除细胞的碎片。
(V) 在冻存之前使细胞长到 8 0 % 〜9 0 % 汇合。
注意: 要 确 保 MEFs 细胞完全没有被任何微生物所污染,每次从小鼠胚胎新制备MEFs, 要在无抗生素的培养基中至少连续传]5 代 ,在这个时期如果没有观察到微生物污染,那么早期传代的细胞就可以扩增,并大量分装冻存起来,随后能够安全地用于日常 H ES 细胞的增殖。
2.3.2 M E F s 的继代培养
为了维持细胞库的供应以及避免出现先前讨论过的细胞衰老,关注 M E F s 的传代次数是关键,简而言之,应该以较低传代次数(p 〇〜p2 ) 的细胞用于维持细胞库,以较高传代次数(P3 和 p4 ) 的细胞用于制备无活性的可支持 h E S 细胞的询养层。 M EFs细胞在 4 代以后不能使用,这很重要,因为这个时期细胞已经衰老并可能很难扩增了。
M E R s 将在 75 cm2 或 225 cm2 的组织培养瓶中生长,这主要取决于需要多少飼养细胞(M E F s)s 在制备饲养层细胞板时,一个 75 cm2 培养瓶的 M E F s 如果灭活时达到80% 汇合,就可以为 2〜6 个 4 孔培养板提供细胞.s.—个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 可用于大量储存细胞或者用来制备大量无活性的饲养层细胞板 a, 在进行 h E S 细胞培养工作
之前. ,有必要准备好充足的细胞储备供应,要确保饲养细胞不短缺。用 225 cm2 培养瓶的大量传代将提供更快的 M E F s 细胞储备,因此方案 2. 2 讨论了一个 225 cm2 培养瓶的M E F s 细胞传代的容量问题。为了工作容量进行传代,可 将 一 个 的 培 养 瓶 平均分为 3 份,而每个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 细胞应该按 1 :3 的比例再产生三个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 用于储备。
方 案 2.2 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(M E F s) 的 传代
试剂与材料
无菌或无菌制备
□0〜3 代的 M E F s 大约 80% 汇合, 75 Cm2 或 225 cm2 培养瓶
□ MEFM (见 2. 2. 3)
□明 胶(高温高压灭菌, 0. 1% W /V
□ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % ,溶 于 GffiCO 溶 液 A ( 见 2. 9 节)
□ PBSA
□台盼蓝活性染色
□ 离 心 管 , 15 ml
□ 组 织 培 养 瓶 , 3 X 225 Cm2
□血细胞计数板
步骤
(a) 从 225 cm2 培养瓶中吸出培养基并用 IOml 的 P B SA 洗一次细胞。
(b) 力口 3m l 的胰蛋白酶并在 37°C 孵育细胞 4 min。
(c) 从孵箱里取出培养瓶并轻轻地敲击使 M E F s 进一步脱离培养瓶。
(d) 加 入 6m l 的 M EFM ,打散所有细胞确保没有粘连并防止成团。
(e) 将培养基和悬浮细胞转人 15m l 离心管中。
(h) 离 心 5m in, lOOOg。
(g) 把 5 ml 0. 1 % 明胶加人 3 个新的无菌的并将有 M E F s 传 人 的 225 cm2 的培养瓶中 ,室温下与凝胶最少孵育 5 min 。
(h) 从离心管中取出 M E F s 并吸出培养基,敲击管壁分散细胞沉淀,用 3m l 新鲜的 M EFM 重悬。用吸管吹散细胞以确保细胞是单细胞悬液,这对于传代培养瓶中细胞的均一生长是必要的。
(i) 从每个新的培养瓶中吸出 5 ml 0 . 1 % 明胶,加 入 25 ml M EFM 培养基。
(j) 把 3m l 的 M E Fs 分配 到 3 个 225 cm2 培养瓶中。
(k) 每 个 225 cm2 培养瓶中的细胞在下次传代时将继续分 3 份 。
来自前三代的 M E F s 细 胞(P0〜P3 ) 的每一代都能冻存起来维持细胞的储备或者被传代 为 h E S 细胞的增殖提供饲养细胞(见 2. 3. 5 节)。
4 代之后, M E F s 应该被丢弃因为这些细胞可能衰老或发生改变。
2.3.3 冻存小鼠胚胎饲养细胞
如 果 M EF 细胞要用于 hES 细胞的培养过程,那就必须维持大量的、高质量的、不同代(PO〜P4) 的 MEFS 冷冻贮存。传代次数早的细胞(p0〜p2 ) 应该作为细胞储备的种子细胞,它们可以继续传代,再次冻存以提供大量的更高代次的细胞(p3〜p4 ) 来 维 持 hES细胞的日常生长。一 个 7Scm2 培养瓶有 8 0 % 汇 合的 M EF 细胞将冻存产生一个冻存管的储
备细胞,一 个 225 cm2 培养瓶的细胞将冻存产生 3 个冻存管的储备细胞。
方 案 2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 冻 存
试剂与材料
无菌或无菌制备
□ 含 有 M EFs 细胞的 75 cm2 培养瓶或 225 cm2 培养瓶, p0〜p4, 8 〇% 〜 90% 细胞汇合
□ M E F M (见 2. 2. 3 节)
□ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , ED TA,溶 于 GIBCO 溶 液 A (见 2. 9 节)
□ E S F B S
□ D M SO
□ P B S A
□ 离 心管, 15 ml
□冻存管
步骤
(a) 从 含 有 MEFs 细胞的培养瓶中去除培养基,并 用 P B S A 洗 一 遍 ,每 个 75 cm2培养瓶用 5 ml。
(b) 每 个 75 cm2 培养瓶中加入胰蛋白酶 lm l,确保整个培养瓶的单层细胞都能被覆盖 , 37℃孵育 4min。
(c) 轻轻地敲打培养瓶使细胞进一步脱落。加 入 5 ml M EFM 终止胰蛋白酶反应,吹 散 5〜6 次确保所有细胞没有粘连并防止成团。把 含 有 M E F s 的 培 养 基 转 人 15m l 离心管。
(d) 离心 5 min, IOOOg
(e) 为冻存准备冻存管及写标签。标 签 内 容 应 该 包 括 M E F s 细胞新传代的代次,曰期和任何可能需要的信息。在无菌条件下将 lOOy DMSO 加人备好的冻存管里。
(f) 吸去上清,小心不要搅乱细胞沉淀。
(g ) 用 E S F B S 重悬细胞沉淀,每 个 75 cm2 培 养 瓶 900uI,用塑料吸管打散细胞,确认细胞沉淀已混勻。
(h) 把 含 有 M E F s 细 胞 的 E S F B S 转 移 到 装 有 DM SO 的冻存 管 里 ,立即储存到-80°C 冰箱过夜,储存之前要 彻底混匀。
(i) 第二天,把冻存管放到液氮里长期保存。
2.3.4 M E F s 细胞的复苏
从长期液氮保存中复苏 M E F 细胞,用于补充 M E F s 的储备或者用于灭活处理后支持未分化 hES 的 生 长 。
方 案 2. 4 复 苏 冻 存 的 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞
试剂与材料
无菌或无菌制备
□ 一 支 M E F s 冻存管
□ MEFM (见 2. 2. 3 节)
□ 明 胶 , 0. 1 % (高温髙压灭菌)
□组织培养瓶, 75 cm2
□ 水 浴 箱 ,设置 在 37°C
□ 吸 管 , Iml
步骤
(a) 在 75 cm2 培养瓶内加 3 ml 0 . 1 % 明胶,覆盖细胞将要黏附的表面,室温孵育至少 5 min
(b) 从液氮罐中取出一支 M E Fs 冻存管。
(c) 在 37°C 水浴箱中快速解冻细胞。
(d) 把 0. 1 % 明胶从 7 5 cm2 培养瓶中吸出并加入 7m l 的 M EFM 培养基。
(e) 用 Im l 吸管把含有 M E Fs 细胞的 E S F B S / D M S O 混合液从冻存管里转移到含有M EFM 培养基的 75 cm2 培养瓶中。
(f) 在 37°C 孵育细胞过夜。
(g) 第二天早上用新鲜的 M EFM 培养基替换 7m l 培养基去除残留的 DM SO 和细胞碎片。
(h) M E F s 细胞生长达 5 天或细胞汇合达到 8 0 % ,每 2 天换一次液。
2.3.5 基于化学方法的 M E R s 细胞失活
MEFs (P0〜P4 ) 是一种快速分裂的细胞,因而在作为饲养细胞层使用之前需要抑制有丝分裂避免其过度生长。细胞分裂的抑制可通过放射和化学阻断方法获得,最普遍的是使用丝裂霉素 C ,它是一种为日常培养 h E S 细 胞 而 准 备 M E F s 细胞的简单、有效的方法。
安全提示:对丝裂霉素 C 进行操作时一定要当心,因为它有遣传毒性。始终要戴手套,并且只能在 I I 类 通 风 橱(小的生物安全柜)内操作。
h E S 细胞的增殖需要使 M E F 细胞失活,一 个 75 cm2 培养瓶大约 8 0 % 汇 合 的 MEFs细胞通常能提供 2 〜4 个(取 决 于 M E F s 细胞的产量)4 孔板 。方 案 2. 5 讨论了一75 cm2 培养瓶或一个 225 cm2 培 养 瓶 的 M E F s 细胞的失活处理,使 用 225 cm2 培养瓶需
要 3 倍试剂和培养基。
方 案 2. 5 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 生 长 抑 制
试剂与材料
无菌或无菌制备
□ 8 0 % 〜9 0 % 汇 合 的 M EFs 细胞, 75 cm2 培 养 瓶(或 225 cm2)
□ MEFM (见 2. 2. 3 节)
□ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , 溶 解 于 GIBCO 溶 液 A (参见 2. 9 节)
□ PBSA
□ 明 胶 , 0. 1 %
□ 丝 裂 霉 素 C (MMC), 50 ug /ml, 溶解 于 DMEM (过滤除菌)
□多孔培养板, 4 孔 :通 常 每 75 cm2 培养瓶的 M E F s 细胞需 要 1 〜4 个培养板
□吸管
□ 离 心 管 , 15 ml
步骤
(a) 用 MEFM 以 1 : 10稀释 MMC,从 50 Mg/ml 稀释至 5 ug/ml。
(b) 在 4 孔培养板的每个孔中加人0.5m l 的明胶。
(c) 从 孵 育 箱 里 取 出 75 cm2 培 养 瓶 ,内 有 8 0 % 汇 合 生 长 的 p3 或 p4 代 的 MEFs细胞。
(d) 用 IOmI 的 5ug/ml:MMC,在 37°C 孵育 MEFs 细胞 2 h。
注意:因为制备的 M E F 细胞可能有变化,新的使用者将要确定 M M C 完全抑制细抱分裂的最佳浓度和孵育时间。
(e) 在 M M C 孵育的期间,把 0 . 1 % 明胶涂到 4 孔板,至少在使用前 5 min 涂板。
(f) 用 M M C 处理完之后,用 5m l 的 P B SA 洗细胞一次。
(g) 加 Im l 胰蛋白酶,于 37℃孵育 4 min。
(h) 轻轻地敲击培养瓶使所有的细胞脱落,并加人等体积的 M EFM 终止胰蛋白酶反应,转 移 到 15m l 的离心管。
(i) 在 含 有 M E F s 细 胞 的 15m l 离 心 管 里 加 人 M E FM 培 养 基 使 总 体 积 达 到 6 ml,IOOOg 离心 5 min。
(j ) 吸去上清,用 5m l 的 M EFM 重悬 M E F 细胞沉淀,仔细确认是单细胞悬液。
(k) 用血细胞计数板计数细胞。
(l) 从 4 孔板吸掉明胶。
(m) 每 个 孔 以 7. 5 X 104 个 接 种 M E F s 细胞 ,并 且 每 个 孔 中 M E F M 的总量达到500ul。 M E F s 细胞将在 6 h 内贴壁。
(H) 把新接种的培养板放到孵育箱里,准备第二天使用。
注意: M E F 细胞在失活之后死亡之前,能够 作 为 h E S 细胞的饲养细胞来使用的时间 为 7 天,理想的情况是把 h E S 细胞传到 M E F s 细胞失活 1〜3 天内的培养板上。
来源:丁香实验