h E S 细 胞 的 手 工 传 代

方 案 2.7 h E S 细 胞 的 手 工 传 代

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落

□ 新 鲜 的 M E F 板（最好是在失活处理后 1〜3 天内）

□ h E S 培 养 基（见 2. 2. 1 节）

□ 50 ul加样器枪头

□玻璃巴氏吸管

非无菌

□ 100M I 加样器，可调节的，调 至 50ul

□火焰裸露的气体燃具或类似设备

□ 解 剖 用 倒 置 显 微 镜 ，最 好 有 一 个 可 设 定 37°C 的加热 台 ，放 在 I I 级层流罩中使用。

步骤

(a) 所有工作在无菌条件下进行，使用外科面具、手套，穿实验室外套。

(b ) 首先，用 500M1 h E S 培养基置换新鲜 M E F 培养板内的 M E F 培养基。

(c) 点燃煤气灯，用蓝色火焰烧玻璃吸管，轻轻旋转玻璃吸管，待柔软时拉长吸管产生比头发丝还要细的、密 封 的 狭 窄 末 端（图 2.1)。

(d ) 马上将所有拉好的吸管置于层流罩内保持无菌，吸管只能在传代时现拉，以减少污染的危险。

(e) 从温箱中取出 h E S 细胞培养皿放在加热的台子上。

(f) 根据它们的外观选择集落的未分化区域，未 分 化 的 h E S 细胞小而圆，紧密而透明。要避免选取棕色细胞区域（图 2.2)，这个区域的细胞正处于自发分化状态。

(g) 用一个拉好的吸管的尖端，沿着未分化细胞区域切下，再切成较小的均等的块儿。典型的集落大小类似于图 2. 2 中所示，根 据 h E S 细胞系所特有的再生长率，可切 割 成 6〜10 块 。

(h ) 集落被切割后，用加样器安上合适的枪头吸取自由漂浮的小团块

(i) 将 集 細 』 转 移 至 新 的 M E F 血中，作为参考指南， —个新鲜 W M E F M可等量分配 4〜6 个较小的团块。

(j) 小心地将新旧 h E S 细胞培养皿放回温箱中，胞贴附，不要聚集在皿的中央。

(k) 第二天在新旧培养皿中再加入 250M h E S 培量换液吸去未贴附细胞的危险性。

注意：为了避免污染，每次伸入一个孔都要用新拉制的无菌的吸管

细胞反复暴露于酶，可能出现遗传改变，虽然必须注意这个问题，但这种方法适合于 h E S 细胞的大批量培养

方案 2 . 8 用肢原酶进行 h E S 细 胞 的 传 代

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落

□ 新 鲜 的 M E F 板（最好是在失活处理后 T〜3 天内）

□ PBSA

□ h E S 培养基

□ 溶 解 于 P B S A 的胶原酶 IV 溶 液（200 U /m l )

□细胞刮或拉长的玻璃吸管（见方案 2. 7)

□机械加样器和吸头

□ 离 心 管 ， 15 ml

步骤

(a) 吸 去 h E S 皿中的培养基，四孔板中的每一个孔用 500pd P B S A 洗两次。

(b) 每孔加人 500/xl 胶原酶 IV 溶液， 37°C 孵 育 8〜 lOmin。

(c) 用一个拉长的玻璃吸管轻轻地分离集落。

(d ) 用机械加样器将细胞转移至无菌的 15m l 离心管中。

(e) 用 750ul 新鲜的 h E S 培养基淋洗 h E S 培养板，将所有细胞集落收集到同一离心管中。

(f) 用加样器在 15m l 离心管中将集落打碎形成 I O 块或更多的小块。

(g ) 750 g离心 2m i n 。

(h ) 小心吸去上清，用 5m l 新 鲜 h E S 培养基重悬细胞。

i) 在 新 鲜 M E F 板的每个孔中，沿四周接种 4〜6 个团块。

ii) 将新接种的 h E S 细胞放入温箱中，贴附过夜，第二天加入新鲜的 h E S 培养基。