人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立

方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 5〜6 天的人胚泡，经 H F E A 允许，并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到（http//:www.hfea.g0v.uk)。

□链霉蛋白酶， 0 . 5 % ，溶 于 DMEM

□ 抗 人 抗 体 ， 3 0 % 〜5 0 %

□含有 Glutamax 的 DMEM

□ h E S 培 养 基（见 2. 2. 1 节）

□豚鼠的补体，用 DMEM I : 1 稀释

□ 4 孔培养板的每个孔以 7.5X 10⁴ 的细胞数接种新的失活的 M EFs，含 有 500ulHES 培养基

□大孔吸管

步骤

(a) 使胚胎生长到胚泡阶段，通常大约 5 天。

(b) 如果胚胎没有从透明圈里孵出，用 5〜IOuI 的 0 . 5 % 链霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。

(c) 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育 i 〇 min，此抗体用含Glutamax 的 DMEM稀 释 3 0 % 〜5 0 % 。

(d) 在孵育之后，用 h E S 培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。

(e) 用 5〜IOmI 2 0 % 的豚鼠补体与胚泡在 37T：孵 育 5〜15 min, 目的是溶解胚胎滋养层，此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎将有助于溶解过程。

(f) 当胚胎滋养层完全溶解，用吸管轻轻地取出完整的内层细胞团并立即转移到含有 500ul h E S 培养基的 M E F s 培养板上。

(g) IC M 细 胞 2〜5 天内将贴壁，要每天观察细胞的生长。要在原位 停 留 1 5 天以上 ，如果需要，可以添加新的灭 活 的 MEFs (只有当集落大到足以传代时才能将它转到新 的 M E F s 培养板上）。

(h) 从 ICM 来源的细胞具有类干细胞的形态，通常出现在集落的中心。

(i) 当克隆达到约 0_1〜0.5 mm 大小时，用拉长的玻璃吸管将它们切割成 2〜10小块并转移到 2〜4 孔新的失活的 M E F s 培 养 板 中（见 方 案 2.7)。这个过程每 5〜7 天重复一次。

(j) 在新建立的 h E S 细胞系前几次传代之后， h E S 细胞的增殖就可按以下方案进行(见 2.5 节）。

注意： 一旦超过单一集落，初 建 的 h E S 细胞系的团块每一代都要冻存直到获得了大量冻存成功的冻存管（见 2 . 6 节）。 前 10〜1 5 代 最 少 5 0 % 的细胞将被冻存直到细胞系被很好的建立。