通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性

方 案 2. 11 通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 生 长 于 0.1 % 明胶包被的玻璃盖玻片上的h E S 细胞

非无菌

□ 4 % 多聚甲醛

□ P B S A

□ T ris-缓 冲 盐 溶 液（T B S 一）

□含有 0.5 % T r i t o n X -100 的 Tris-缓 冲 盐 溶 液（T B S + )

□ 奶 粉 ， 5 % W /V ，去 离 子 水（d H 20 ) 配制

□ 一抗； S S E A -1、 -3、 -4、 T R A -1-60、 -1-81 及 0 C T -4

□适宜的二抗

□ 封 片 剂 ，如 Fluorosave

□吸气器和吸液管

□铝箔

□纸板染色盘

□ 可 置 于 2 4 孔板的玻璃盖玻片

□ 平 板 摇 床（可选择）

□荧光显微镜和相机

步骤

第 1 天

(a) h E S 细胞可生长于M E F 伺养层细胞上一起染，因 为 M E F s 不会表达 任 何 hES细胞的标志物。一个24孔板要接种5 X IO⁵ 个经丝裂霉素 C 灭 活 的 M E F s ，种 在 0.1 %明胶包被的13m m 玻璃盖玻片上，如 前 所 述（方 案 2. 5)。

(b ) 在固定之前， h E S 细胞最好要 传 代 至 有 M E F 细 胞 的 盖 玻 片 上 生 长 2〜3 天 ，以使细胞贴附并生长成单层，每一种抗体至少要用两孔h E S 细胞进行染色。

(c) 从生长着 h E S 细胞的盖玻片上吸去h E S 培养基，用 500W P B S A 洗一次。

(d ) 用 4 % 的多聚甲醒固定30 —— 4 0 m i n 。

(e) 吸去固定液，用 5 0 0 4 P B S A 洗一次。

(f) 每孔加 人 500f i l T B S + , 室 温 孵 育 15m i n , 最好放在平板摇床上摇，吸液时要小心 ，不要碰掉细胞。

(g ) 吸去 T B S + , 重 复 步 骤（f) 4〜5 遍 ，以保证细胞被彻底清洗。 T B S + 也使细胞渗透性增加，使抗体染色更充分。

(h ) 清洗结束时，用 500ul 溶 解 于 去 离 子 水 的 5 % 奶 粉 溶 液 孵 育 细 胞 30〜60m i n ，以阻断非特异性的抗体结合。

(i) 在此孵育过程中，根据供应商的提示，用 5 % 奶粉溶液稀释好一抗。

(j) 吸去奶粉溶液，重 复 洗 的 步 骤（f) 4〜5 次 ，已保证除去所有非特异性结合的抗体。

(k ) 每 孔 用 250〜500M 1相应的一抗 5 % 奶粉溶液孵育，室温过夜。最好放在平板摇床上摇，或者要确认细胞已被浸没。

注意：加液和吸液时要小心谨慎，以避免抗体的交叉污染。

第 2 天

(a) 吸去一抗溶液，每一种抗体用不同的吸头以避免交叉污染。

(b ) 用 T B S — 洗细胞，每 孔 500m 1。

(c) 用 T B S 醉育细胞，每 孔 500jlJ , 15m i n ，放在平板摇床上。

(d) 吸 去 T B S ‘ ，重 复 步 骤（c) 4〜5 遍 ，以保证除去一抗。

(e) 在清洗孵育过程中，可 用 TBS+ 配制相应 的 二 抗 ，每 孔 需 要 250〜 500ul抗体一T B S 1溶液 ，根据是否使用平板摇床来决定加的量（250ul 或 500ul)。

注意：如果使用 D N A 荧光染色显示核，要在这时阅读步驟（g )。

(f) 清洗结束时，吸 去 T B S - 溶 液 ，每 孔 加 250〜500ul抗体-T B S + 溶液孵育细胞，放在平板摇床上，室温孵育至少 l h 。

(g ) Hoechst 33258或 D A P I 可用于显示 h E S 细胞的核，可能要以适宜的浓度加人到二抗溶液中，可与二抗溶液一起孵育。

(h ) 用相应的封片剂封片，如 Fluorosave。

(i) 用荧光显微镜和照相设备观察之前，要让片子彻底干燥。

注意：所有 的 二 抗 以 及 用 二 抗 孵育的板都要用铝箔包 起 来 ， 以 防 被 日 光 漂 白 。

方 案 2. 12 R T -P C R 合 成 h E S 细 胞 的 c D N A

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 几 小 块 h E S 细胞集落，按照与常规传代相同的方法制备（见 2. 5. 1. 2 节

非无菌

□ R N A 提取试剂盒，如 R N A e a s y

D 5 X A M V - R T Superscript e n z y m e

□ 缓 冲 液 ：含 10m m o l / L M g C l 2 的 A M V - R T

□ 引 物 ： oligo (d T )I8, 2ug/ul

□ 引 物 ： oligjj C d N >i。， 2ug/ul

□ 核 苷 ： d N T P s ， 2m m o l / l

□核糖核酸酶抑制剂 ： R N a s i n

□ 模 板 ：提 取 的 R N A ， 2ug

□ 无 R N A 酶的水

□ 设 置 在 70°C 的加热块

□ P C R 热循环仪

□加样器和吸头

□冰

步藤

(a) 使 用 R N A 提取试剂盒，按照制造商的说明书从 h E S 细胞制备 R N A 模板

(b ) 准 备 R T -P C R 的预混液：

d N T P s , 2m m o l / L 1ul

方 案 2. 13 通 过 P C R 分 析 h E S 细 胞 的 基 因 表 达

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 几 小 块 h E S 细胞集落，按照与常规传代相同的方法制备（见 2. 5. 1.2 节）。

非无菌

□10XTaq 缓冲液（标准液是 25 mmol/L MgCl2）

□ T a g D N A 多聚酶

□ d N T P s ， 2m m o l / L

□ R T -P C R 合 成 的 c D N A 模板

□ 高 压 消 毒 的 d H 20

□琼脂粉

□溴化乙啶

□ 5 X 上样染料

i v ) 将一个梳子放人 P C R 胶的模具中，将热的混合物轻缓地灌人。注意不要产生气泡，因为气泡会妨碍 D N A 在胶中的迁移。

V) 拔 梳 前 置 室 温 30m i n , 使胶冷却直至凝同，放在电泳 槽 中 ，以 50m m o l / L溴化乙啶缓冲液覆盖之。

(d ) P C R 循环完成后，将样品从循环仪中取出。

(e) 每个样品中加 5M 1 上样染料，将样品加至胶中，确认同时加了 肌动蛋白阳性对照样品以及 D N A 梯形标准品。

(f) 开始电泳， 100V ， 30〜40m m , 直 到 D N A 梯形标准品已经清楚地分开，在紫外灯下很容易区分。

(g ) 用 一 个 U V -透 视 器（波 长 315n m ) 看 胶 ，如果需要，用相机拍照。

(h ) 将每一个样品的所有 D N A 片 段 与 D N A 梯形标准品相比较，观察是否有预期的 带（前已述及），（3-肌动蛋白阳性对照样品也要被证实已经显示。

(i) 预期大小的 D N A 条带可以用洗胶试剂盒（如 G E N E C L E A N ® ) 很容易提取出来 ，并且应该通过测序来证实。