采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞

方 案 2. 9 采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞

试剂与材料

无菌或无菌制备
□ 生 长 于 M E F 饲养层之上的未分化的 h E S 细胞

□ hES-HEPES 培 养 基（见 2. 2. 2. 1 节）

□ 1 0 % 玻 璃 化 溶 液（见 2. 2. 2. 4 节）

□ 2 0 % 玻 璃 化 溶 液（见 2. 2. 2. 5 节）

□ 多 孔 板 ， 4 孔（图 2.3a)

□开口拉长的玻璃化小管（图 2.3b )

□ 冷 冻 管 ， 4. 5 ml

□ 拉 长 的 玻 璃 吸 管（见方案 2.7, h E S 细胞的手工传代)

□加样器枪头， 80M1

□ 配 有 大 孔 针 头（14 G) 的注射器

非无菌

□ 加 样 器 ，设 置 在 80W

□倒置解剖显微镜，有一个可加热至 37°C 的台子，放 在 II 级层流罩中。

□装满液氮的粗颈真空液氮罐

□长臂的镊子

□取液氮用的适宜安全设备

步骤

(a) 准备一个玻璃化板（见 图 2.3a)

孔 I : h E S - H E P S E 培养基， Im I

孔 2 : 空白

孔 3: 1 0 % 玻璃化溶液， Iml

孔 4: 2 0 % 玻璃化溶液， Iml

朝上的盖子： IOfd 2 0 % 玻璃化溶液

(b ) 使用前将板置于温箱中 2m i n ，预 温 。

(C) 将 h E S 细胞系的名称、代 数 、时 间 以 及 其 他 相 关 信 息 预 先 写 在 4.5 ml 冷冻管上。

(d ) 将大孔注射器针头放在燃气灯上小心加热，用 它 在 4. 5m l 冷冻管的顶部和底部戳一个洞，使液氮可以在管内自由流动，这有助于保持细胞在保存过程中一直是冷冻状态。

(e) 将 h E S 集落切割成小块，大小约两倍于传代所需的团块。小的集落团块经不住融化步骤，因此在大批冻存前，要测定每个 h E S 细胞系团块的大小是否正确。

(f) 将 6〜8 块集落小块转移至孔 1 中， 60s 。

(g ) 用加样器将所有集落小块从孔 1 转 至 孔 3 , 精确计时 60s

(h) 将集落小块从孔 3 转至 孔 4 , 精 确 计 时 30s。一定要精确计时，因为在非冷冻状 态 下 D M S O 溶液对细胞有毒性。

(i) 将集落小块转移至 I O p d 小滴中。

(j) 用一个加样器，在吸头的末端安上玻璃化小管（见 图 2.3b ) , 小心但迅速地将含有集落小块的溶液吸入。

(k ) 小心移去吸头，用一对长臂镊子将小管稍微倾斜浸人液氮，使细胞瞬间冷冻。

(l) 一 旦 冻 住（约 5〜10s) ，就将小管放入 4.5m l 冷冻管，再放回液氮中。

(m ) 当液氮充满冷冻管时，将存有小 管 的 4.5m l 冷冻管放入长期保存的液氮储存器中 ，用于日后复苏。

2.6.2 解冻 hE S 细胞

h E S 细胞的解冻速率具有很大可变性，因 此 最 好 是 「经验操作」，确定冻存集落的最适大小，获得解冻之后的最大的再生长。

方 案 2. 10 解 冻 玻 璃 化 冻 存 的 h E S 细胞

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ —小管冷冻的 h E S 细胞集落小块，最好放在一个可移动的液氮容器内。

□ M E F 板（最好在用前失活处理 1〜3 天）

□ h E S - H E P E S 培 养 基（见 2. 2. 2. 1 节）

□ 蔗 糖 溶 液 ， 0. I m o l / L (见 2. 2, 2. 3 节）

□ 蔗 糖 溶 液 ， 0. 2m o l / L (见 2. 2. 2. 2 节

□ 多 孔 板 ， 4 孔（图 2. 3a)

□ 80ul 加样器枪头

非无菌

□ 加 样 器 ，设 置 在 80ul

□倒置解剖显微镜，有一个可加热至 37°C 的台子，放 在 II级层流罩中。

□装满液氮的隔热容器

□长臂镊子

□取液氮用的适宜安全设备

步駿

(a) 如 图 2. 3 所示准备及预温解冻板：
孔 1，蔗糖 0.2molL ……………………………… Iml

孔 2 ，蔗糖， 0.lmolL ………………………….. Im I

7L 3 和孔 4， hES - HEPS培养基 ………….. …….1ml/孔

(b) 从长期液氮储存器中取一个冷冻管放入 一 个便携式液氮容器中。

(c) 用镊子取一个 h E S 细胞的小管，放入层流罩中。

(d) 快速操作，用手指压住小管的上端，将狭小的末端浸人含有0.2m 1/L 蔗糖的孔 1 中。

(e) 只要冻存物一融化，就要立 即 取 出 h E S 细 胞 团 块 放 至 蔗 糖 溶 液 中（用加样器排出所有剩余溶液）。

(f) 精确 孵 育 60s ，而后转入孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖）中。

(g ) 在 孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖）中孵育 60s。

(h ) 将细胞转移至孔 3 (h E S -H E P E S ), 5m i n 。

(i) 解冻的最后一个步骤，将细胞转移至孔 4, 5m i n 。

(j) 经过最后一个步骤之后，用加样器收集 h E S 细胞接种于 M E F s , 如 前 所 述（见方 案 2. 7)。