丁香实验_LOGO丁香通
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

荧光蛋白表达细胞的流式细胞术分析

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

荧光蛋白的实用性在于它可以实时的监测蛋白表达和定位。而很多情况下对这些蛋白的应用需要利用荧光激活的细胞分选仪(FACS)对细胞进行准确和定量地分析和分选。我们特别介绍利用 FACS 来分选有 EGFP(增强绿色荧光蛋白)表达和基因诱捕的内源性启动子的细胞。利用荧光报告基因进行基因诱捕为我们提供了一种敏感的方法来校准诱捕的基因表达水平和回收那些表达追踪基因的细胞。本方法将阐明以下几点:① 荧光载体转染细胞过程;② 利用流式细胞术分析细胞内基因表达情况;③ 分选表达荧光蛋白的细胞;④ 在细胞生长过程中 EGFP 蛋白的稳定性;⑤ 一种简单而有效的区分低表达增强绿色荧光蛋白细胞和自发荧光的方法。

来源:丁香实验团队

操作方法

将荧光蛋白表达载体转染到细胞

将荧光蛋白表达载体转染到细胞实验基本过程可分为以下几步:A. 采用下述载体和方法建立稳定表达荧光蛋白的 Jurkat 和 P19 EC 细胞。将 pIV 质粒电转到 Jurkat 细胞(SC,Pruitt,未发表数据)。P19 EC 细胞则电转入 pIV 或基因捕获载体而构建基因捕获文库,如图 13-1B 所示。基因捕获载体的特点是从 5'到 3'端包含有一个剪切位点,一个三联的转录终止序列,后者

同时检测多个荧光蛋白

同时检测多个荧光蛋白可以检测的荧光蛋白的数量取决于仪器和可使用的激光通道。在下表中,有一些仪器设备配置,主要是基于荧光蛋白的性质和可以用来激发这些荧光蛋白的激光器。有五种不同的激光器可以使用。氩气激光器是目前最常用的多功能激光器,因为它能够被设置在紫外范围内的 350 nm 到 360 nm,以及 458 nm 或 488 nm。氩激光器可以在紫外或 458 nm 波长下使用,氪激光器可以在 40

抑制荧光蛋白检测时的异质性

抑制荧光蛋白检测时的异质性实验基本过程可分为以下几步:A. 要确保实验中使用的诱捕载体表达 EGFP 不形成融合蛋白而导致细胞内分布异常。B. 调整流式分选的参数。可以降低检测管中的流速,在光子收集过程中旋转细胞。这样的目的是使从各个方向收集的细胞具有平均荧光强度,与细胞上 EGFP 蛋白的表达相一致。这两个改进很大程度上提高了指定窗口内的细胞收集和测定的准确性。借助这些改进,当前的技术可以保证足

关于细胞生长造成的信号强度改变的补偿

关于细胞生长造成的信号强度改变的补偿实验基本过程可分为以下几步:A. 一个可能的影响因素是虽然已经定义了细胞的荧光表达水平,但是细胞表面的荧光强度并不是一个稳定的时间函数。B. 第一通道(被记为「开始」)显示了一群基因捕获的细胞的荧光分布情况。C. 实验的第 1 天,细胞被富集到一个特殊的荧光窗口,如标记为「富集」的第 2 个通道所显示。D. 经过 1 周的培养,对富集的细胞荧光进行再次分析。E.

抑制自发荧光的简单方法

抑制自发荧光的简单方法是为了解决在荧光蛋白表达水平较低的情况下,细胞的自发荧光可能会遮蔽有用的信号这一问题。该方法可以降低绝大多数的自发荧光,但不影响荧光蛋白产生的荧光。该方法可以用在任何目的的想要降低相对于荧光蛋白表达自发荧光。该方法的基础即是细胞自发荧光可以在宽波谱的可见光下很快淬灭,而荧光蛋白表达却很少受影响。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序