抑制自发荧光的简单方法

抑制自发荧光的简单方法是为了解决在荧光蛋白表达水平较低的情况下，细胞的自发荧光可能会遮蔽有用的信号这一问题。该方法可以降低绝大多数的自发荧光，但不影响荧光蛋白产生的荧光。该方法可以用在任何目的的想要降低相对于荧光蛋白表达自发荧光。该方法的基础即是细胞自发荧光可以在宽波谱的可见光下很快淬灭，而荧光蛋白表达却很少受影响。

器材：

① 一台荧光激活细胞分选仪及分析系统（可选）；

② 真核荧光蛋白表达载体系统（例如，BD clontech 公司帕罗奥图，加州 Living Colors 载体）；

③ 限制性内切酶和缓冲液，大肠杆菌宿主株（如 HB101），培养基（如 LB）和氨苄青霉素；

④ 细胞：Jurkat，P19 胚胎瘤（EC）及 HEK293；

⑤ 培养基：RPMI 1600 用于 Jurkat 细胞；DMEM 用于 P19 和 HEK293 细胞；

⑥ 电穿孔仪器和样品槽（如 Bio-Rad 公司产品，海格立斯，加州）；

⑦ 白炽灯光源（如光纤灯等）；

⑧ 固定剂（如多聚甲醛）。

试剂：

① 磷酸钙（CaPO₄）转染试剂：250 mM CaCl₂，2X HBS（280 mM NaCl，50 mM N-（2-羟乙荃）哌嗪-N-2-乙磺碱（HEPES），1.5 mM Na₂H₂PO₄，pH7.1），无菌水；

② 标准细胞培养试剂和添加剂；

③ Geneticin（G418）（Invitrogen 公司，尤尔斯巴德，加州）；

④ DNA 染料（如 Hoechst 33342）。

抑制自发荧光的简单方法实验基本过程可分为以下几步：

A. 在进行 FACS 之前，将细胞暴露在可见光下，使自发荧光优先淬灭，而不影响荧光蛋白的荧光，然后即刻进行 FACS 分析。比如可以在 FACS 仪器的液流位置处安置一个高强度的光纤白炽灯光源来完成这一试验。

B. 下图反映了对自发荧光进行处理后与 EGFP 荧光比较的 FACS 分析结果。一个是没有荧光报告蛋白（上图），另一个则由基因诱捕质粒表达的低水平 EGFP 蛋白细胞和不表达 EGFP 的混合细胞群（下图）。在每组中，细胞经过或不经过光照处理，柱状图表示的是它们的荧光强度的交叠分布情况。

C. 在没有荧光报告蛋白（上图）的组，光照处理后，全部细胞的荧光强度峰发生一个向低水平的偏移，表明自发荧光的减弱。相反，在含有低水平 EGFP 蛋白表达细胞和不表达 EGFP 细胞的混合群（下图），只有那些不表达 EGFP 蛋白的细胞发生荧光强度的偏移。由此，我们利用这一处理有效地扩大了荧光蛋白报告基因可检测的下限。