将荧光蛋白表达载体转染到细胞

器材：

① 一台荧光激活细胞分选仪及分析系统（可选）

② 真核荧光蛋白表达载体系统（例如，BD clontech 公司帕罗奥图，加州 Living Colors 载体）

③ 限制性内切酶和缓冲液，大肠杆菌宿主株（如 HB101），培养基（如 LB）和氨苄青霉素

④ 细胞：Jurkat，P19 胚胎瘤（EC）及 HEK293

⑤ 培养基：RPMI 1600 用于 Jurkat 细胞；DMEM 用于 P19 和 HEK293 细胞

⑥ 电穿孔仪器和样品槽（如 Bio-Rad 公司产品，海格立斯，加州）

⑦ 白炽灯光源（如光纤灯等）

⑧ 固定剂（如多聚甲醛）

试剂:

① 磷酸钙（CaPO₄）转染试剂：250 mM CaCl₂，2X HBS（280 mM NaCl，50 mM N-（2-羟乙荃）哌嗪-N-2-乙磺碱（HEPES），1.5 mM Na₂H₂PO₄，pH7.1），无菌水；

② 标准细胞培养试剂和添加剂；

③ Geneticin（G418）（Invitrogen 公司，尤尔斯巴德，加州）；

④ DNA 染料（如 Hoechst 33342）。

将荧光蛋白表达载体转染到细胞实验基本过程可分为以下几步：

A. 采用下述载体和方法建立稳定表达荧光蛋白的 Jurkat 和 P19 EC 细胞。将 pIV 质粒电转到 Jurkat 细胞（SC，Pruitt，未发表数据）。P19 EC 细胞则电转入 pIV 或基因捕获载体而构建基因捕获文库，如图 13-1B 所示。基因捕获载体的特点是从 5＇到 3＇端包含有一个剪切位点，一个三联的转录终止序列，后者可以终止转录内源性蛋白，另外还有一个内在的核糖体插入位点和一个报告基因（如 EGFP），一个多聚腺苷酸尾、一个来自（希文）-β-珠蛋白的绝缘子序列，一个 Pgk 启动子，以及新霉素抗性基因和供体剪切位点。

B. 电穿孔时载体被线性化，然后导入细胞。利用 Bio-Rad 公司的 Gene Pulser Ⅱ，参数为 200 V，500 μF。1 ml 中含有 1 × 10⁷ 细胞，大约 40～60 μg DNA。

C. 细胞在 G418 存在情况下培养 10 d，存活细胞大约来自 1500 个克隆。细胞经胰酶消化，传代扩增，直到大约 5 × 10⁷。这些细胞经过胰酶消化和滤过标准程序处理，为 FACS 分析做准备。(也可以采用瞬时转染方法获得表达 DsRed2，EGFP，EYFP，和 ECFP 荧光蛋白质粒, 的细胞这些荧光蛋白都是构建在一个在第二个 CDNA3＇端带有双顺反子的平行质粒中（图 13-2）。这些重组构建载体利用磷酸钙法，被分别转染到 HEK293 细胞。2 d 后，细胞被经标准方法滤过处理，1.5％ 甲醛固定后用于流式分析)