关于细胞生长造成的信号强度改变的补偿

器材：

① 一台荧光激活细胞分选仪及分析系统（可选）；

② 真核荧光蛋白表达载体系统（例如，BD clontech 公司帕罗奥图，加州 Living Colors 载体）；

③ 限制性内切酶和缓冲液，大肠杆菌宿主株（如 HB101），培养基（如 LB）和氨苄青霉素；

④ 细胞：Jurkat，P19 胚胎瘤（EC）及 HEK293；

⑤ 培养基：RPMI 1600 用于 Jurkat 细胞；DMEM 用于 P19 和 HEK293 细胞；

⑥ 电穿孔仪器和样品槽（如 Bio-Rad 公司产品，海格立斯，加州）；

⑦ 白炽灯光源（如光纤灯等）；

⑧ 固定剂（如多聚甲醛）。

试剂:

① 磷酸钙（CaPO₄）转染试剂：250 mM CaCl₂，2X HBS（280 mM NaCl，50 mM N-（2-羟乙荃）哌嗪-N-2-乙磺碱（HEPES），1.5 mM Na₂H₂PO₄，pH7.1），无菌水；

② 标准细胞培养试剂和添加剂；

③ Geneticin（G418）（Invitrogen 公司，尤尔斯巴德，加州）；

④ DNA 染料（如 Hoechst 33342）。

关于细胞生长造成的信号强度改变的补偿实验基本过程可分为以下几步：

A. 一个可能的影响因素是虽然已经定义了细胞的荧光表达水平，但是细胞表面的荧光强度并不是一个稳定的时间函数。

B. 第一通道（被记为「开始」）显示了一群基因捕获的细胞的荧光分布情况。

C. 实验的第 1 天，细胞被富集到一个特殊的荧光窗口，如标记为「富集」的第 2 个通道所显示。

D. 经过 1 周的培养，对富集的细胞荧光进行再次分析。

E. 随着接下来为期 1 周的生长，开始时的荧光（左侧通道）与经过 2 次富集的细胞群的荧光（右侧通道）进行比较，但是没有发现明显的荧光光谱变窄。

F. 为了解释下面的随着时间推移，细胞上的荧光水平散射的原因，细胞被锁定在很短的时间段内，如 20 h。一个几乎一样的荧光性状的漂移出现在 20 h 和 1 周后（没有显示），说明下面的现象并不是遗传或表观遗传的不稳定性所引起的。

G. 细胞周期中的荧光强度分布

DNA 的含量可以通过染料 Hoechst 33342 来测定。右侧图显示荧光较暗的主要偏向于 G 期细胞，而较亮的主要偏向于 G2 期细胞。这种细胞周期和信号强度之间的相互关系也可以通过前散射来反映。

H. 表达不同荧光强度的细胞可被分选开来，即按照荧光值与前散射通道上，定义水平的（左上通道）或倾斜的（左下通道）分选窗口来分选。所选的初始分选窗口而使大约 43％ 的起始细胞群落在水平的或倾斜的窗口中。分选 1 次的细胞，如果没有其他的方法来改进分选，则任何因素的影响都可归结为分选窗口的变化。

I. 分选的细胞大约培养 24 h，然后再来用初始的分选窗口评估阳性细胞的比例（右上的水平窗口和右下的倾斜窗口）。在水平窗口中，细胞的比例从开始时的 43％ 下降为 41％。相反，在倾斜窗口，细胞比例从 43％ 上升为 54％。这一试验表明在没有其他的技术来改进分选效率的情况下，单通分选时使用细胞周期补偿可以提高细胞分选效率。