同时检测多个荧光蛋白

同时检测多个荧光蛋白可以检测的荧光蛋白的数量取决于仪器和可使用的激光通道。在下表中，有一些仪器设备配置，主要是基于荧光蛋白的性质和可以用来激发这些荧光蛋白的激光器。

有五种不同的激光器可以使用。氩气激光器是目前最常用的多功能激光器，因为它能够被设置在紫外范围内的 350 nm 到 360 nm，以及 458 nm 或 488 nm。氩激光器可以在紫外或 458 nm 波长下使用，氪激光器可以在 407 nm 或 413 nm 波长下使用。

另外，紫色波段的固体激光器可以在 405~408 nm 波长范围使用，来激发 ECFP。如果使用 488 nm 的氩激光器，EGFP、EYFP 和 DsRed FP 荧光蛋白可以被激发。如果使用两个氩激光器，一个在 458 nm，可以激发 EGFP 和 ECFP，另一个在 488 nm，可以激发 EYFP 和 DsRed FP。在这种设置下，四种荧光蛋白可以被同时检测。

单激光或双激光激发有几种方法可以来设置流式细胞仪，检测 4 色载体蛋白，我们这里采用的是 Hawley 的方法。激发光的选择取决于可以被实验人员所使用的激光器。只有一个理想的激光组合，还有一些可接受的其他的组合，但是后者对某些载体蛋白可能效果并不满意。

荧光蛋白	激光器（nm）	最大激发光谱（nm）	最大发射光谱（nm）	消光系数	量子产率
ECFP	氩离子紫外激光器	434	477	26,000	0.4
氩离子激光器-458
氪离子激光器-407
氪离子激光器413
氪离子激光器-407
固体激光器-405
EGFP	氩离子激光器-458	489	508	55,000	0.6
氩离子激光器-488
EYFP	氩离子激光器-458	514	527	84,000	0.6
氩离子激光器-488
氩离子激光器-514
固体光器-532
DsRed FP	氩离子激光器-488	558	583	22,500	0.7
氩离子激光器-514
固体激光器-532
氪离子激光器-568
调色激光器-570
HeRed Fp	氩离子激光器-568	588	618	20,000	0.015
调色激光器-570

器材：

① 一台荧光激活细胞分选仪及分析系统（可选）

② 真核荧光蛋白表达载体系统（例如，BD clontech 公司帕罗奥图，加州 Living Colors 载体）

③ 限制性内切酶和缓冲液，大肠杆菌宿主株（如 HB101），培养基（如 LB）和氨苄青霉素

④ 细胞：Jurkat，P19 胚胎瘤（EC）及 HEK293

⑤ 培养基：RPMI 1600 用于 Jurkat 细胞；DMEM 用于 P19 和 HEK293 细胞

⑥ 电穿孔仪器和样品槽（如 Bio-Rad 公司产品，海格立斯，加州）

⑦ 白炽灯光源（如光纤灯等）

⑧ 固定剂（如多聚甲醛）

试剂:

① 磷酸钙（CaPO₄）转染试剂：250 mM CaCl₂，2X HBS（280 mM NaCl，50 mM N-（2-羟乙荃）哌嗪-N-2-乙磺碱（HEPES），1.5 mM Na₂H₂PO₄，pH7.1），无菌水

② 标准细胞培养试剂和添加剂

③ Geneticin（G418）（Invitrogen 公司，尤尔斯巴德，加州）

④ DNA 染料（如 Hoechst 33342）

同时检测多个荧光蛋白实验基本过程为以下步骤：

对于所有 5 种荧光蛋白，需要空间上分离的三激光器来最佳化地激发包括 HcRed FP 在内的 5 种荧光蛋白条件。下图显示了 3 种空间上分开的激光器的设置，分别是 405 nm 的固相激光器，488nm 的氩激光器和 570 nm 的调色激光器（氩离子泵浦激光器）。另外，568 nm 的氮激光器可以替代 570 nm 的调色激光器。这种配置在 Beckman Coulter、BD 公司和 DakoCyto-mation 公司的细胞分选仪上已应用。这种配置与单激光或双激光器（迈阿密，佛罗里达州）加上第 3 个激光器来激发 DsRed FP 和 HcRed FP 的情形很类似。