细胞培养实验

利用流式衰老抗体染色特定组织细胞，随后根据发射光的荧光强度和波长将不同类型衰老细胞分选出来，进一步研究衰老细胞理化性质。

免疫细胞化学与免疫细胞荧光两者实现的实验目的相似，但各有优缺点方法比较方法优点缺点免疫细胞化学样品可长期保存一次只能标记一种蛋白免疫细胞荧光步骤较简单，可同时标记不同蛋白，图片观赏性强样品保存时间较短

肿瘤干细胞 （CSC） 是指肿瘤内不仅具有自我更新能力还拥有较强侵袭迁移能力的那一小部分细胞，常常在化疗治疗后驱动肿瘤恶变和复发，与肿瘤的存活、增殖、转移和复发密切相关。传统上，肿瘤干细胞会从癌细胞系和肿瘤活检组织中分离出来，并在三维肿瘤球状体悬浮培养物中生长，成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法，目前肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的主要手段。判断单个细胞在适宜的条件

是在体外，经过 3D 培养，能够在体外模拟正常（或疾病）状态下体内器官（或组织）的三维结构和生理功能。通俗点讲，类器官是三维细胞培养物，将干细胞培养于基质胶中，在化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下经过培养得到的相应器官类似的组织结构。

一、试剂配制 1. PY 试剂的配制：PY 1.0 g 以 100 ml 蒸馏水溶解，配成母液，置 4℃ 冰箱保存。PY 工作液：取 1 ml PY 母液，加入 1 mol/L pH 4.7 的醋酸缓冲液 100 ml，稀释为 0.01% 的浓度。 2. 1.0 mol/L pH 4.7 醋酸缓冲液的配制：冰醋酸 11.55 ml 加蒸馏水至 1000 ml；无水醋酸钠 16.4 g 加蒸馏水

取 20 mg 异硫氰酸荧光素，加 20 ml 无水乙醇，使 FITC 充分溶解，即为染色液的原液，保存于 4℃ 冰箱待用。具体荧光染色步骤如下：1. FITC 贮存液的稀释：用 pH 7.4 的 PBS 液稀释成 50 ug/ml 浓度的工作液，备用。2. 被染色细胞首先用 70% 酒精破膜，作用 10 min，使 FITC 染料能进入到细胞中。3. 用离心法以 PBS 液洗去破膜剂，离心收集细

细胞生长至对数中晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻。市场上有多家成熟的无血清冻存液，这些试剂简单实用，极其便捷。对一些难复苏的细胞极其友好。但是对于长期的细胞留库保种还是建议采用传统的方法。两种冻存液比较方法优点缺点传统 DMSO/甘油冻存法能较好的维持细胞的特性一些细胞冻存效果不佳无血清无蛋白冻存法使用方便，对新手友善同样含有 DMSO，某些敏感细胞慎

原代提取目的细胞会混杂着大量的其它细胞，通过不同生物酶的梯度消化、差速贴壁等能够得到纯度较高的目的细胞群。胶原酶是一种从细菌中提取的酶，对胶原消化作用强，适用于纤维组织及上皮组织的消化，其中胶原酶 I 和分散酶 II 消化结肠组织时可以使细胞间质的脯氨酸多肽水解，达到分散细胞，而不影响上皮细胞的效果，采用相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞可获得纯度较高的结肠上皮细胞。

人肾小管上皮细胞 HK-2 属源于正常肾的近曲小管细胞，通过导入 HPV-16 E6/E7 基因而获得永生化。

免疫荧光通过抗体与示踪物质结合，利用抗原-抗体结合反应，进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。免疫荧光与免疫细胞化学比较方法优点缺点免疫荧光步骤较简单，可同时标记多种蛋白，图片伪彩色观赏性强荧光容易淬灭，样品保存时间不长免疫细胞化学样品适合长期保存步骤繁琐，一次只能标记一种蛋白