细胞球状体形成实验

肿瘤干细胞 （CSC） 是指肿瘤内不仅具有自我更新能力还拥有较强侵袭迁移能力的那一小部分细胞，常常在化疗治疗后驱动肿瘤恶变和复发，与肿瘤的存活、增殖、转移和复发密切相关。

传统上，肿瘤干细胞会从癌细胞系和肿瘤活检组织中分离出来，并在三维肿瘤球状体悬浮培养物中生长，成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法，目前肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的主要手段。判断单个细胞在适宜的条件下自我更新的能力通常用细胞球形成的效率来表示。

球状体形成测定主要应用在癌症干细胞研究和人类肿瘤细胞的研究中。通过此方法可以评估各种不同的细胞表面标志物和信号通路对肿瘤干细胞样细胞（CSC）表型的影响，同时此方法可有效的检测恶性细胞、肿瘤发生以及评估癌细胞的耐药性。

癌细胞（本文以结直肠癌细胞为例）

RPMI 培养基、DMEM/F12 培养基

L-谷氨酰胺、抗生素（青霉素/链霉素）

EDTA 溶液、6/12/24/96 孔板、烧瓶

试管等

一、干细胞培养基的制备

1. 使用 DMEM/F-12 培养基。可选择补充 1 U/ml 青霉素/链霉素。

2. 加 10 ng/ml 浓度的人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml 浓度的人重组表皮生长因子（EGF）和 N-2（100 X）补充剂等生长因子。

二、球状体形成

1. HCT116 细胞在 RPMI 培养基中生长，在组织培养瓶中添加 10% 灭活胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。

2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中培养。每 3~4 天更换一次培养基。（本培养基不含青霉素/链霉素）。

3. 当细胞融合 60~80%，抽吸培养基后用 3 ml 预热无菌 PBS 洗涤 2 次。加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在 37 ℃ 培养箱中消化 5 分钟。

4. 在每个培养瓶中加入 6 ml 全培养基中和胰蛋白酶，上下移动细胞以获得单细胞悬浮液。将完整的细胞悬浮液转移到 15 ml 标记的 Falcon 试管中。

5. 在室温下将细胞 350×g 离心 5 分钟，抽吸上清，将微球重悬于 4~6 ml 无菌 PBS 中。

6. 用血细胞计数器计数细胞，调整细胞数量至每 2 ml 完整干细胞培养基中含有 3000 个。

7. 精确计数后，取 200 μL 非血清培养基以 200 个细胞/孔密度加入 96 孔板，每组 10 孔。并在 37 °C和 5% CO₂ 的标准条件下培养细胞两周。第 14 天观察到具有刚性边缘的结肠球。

8. 每 3~4 天更换一次新鲜制备的完整干细胞培养基。当结肠球生长为漂浮的球形菌落时，更换培养基。

9. 使用荧光显微镜对每组随机选取的 5 个区域进行成像，观察细胞成球情况并计算细胞成球效率，球体百分比按球体数/200 计算。

添加生长因子时，应在使用前添加生长因子。

球体形成的第 5 步，混合细胞时容易产生气泡，应避免气泡的产生。