细胞系培养与传代（HK-2 为例）

人肾小管上皮细胞 HK-2 属源于正常肾的近曲小管细胞，通过导入 HPV-16 E6/E7 基因而获得永生化。

用于 HK-2 细胞实验。

CO₂ 培养箱、倒置显微镜、超净台、离心机、37 ℃ 水浴锅、HK-2 细胞、DMEM/F12 培养基、FBS、0.25% 胰酶、PBS、培养皿、15 mL 离心管、冻存管、记号笔。

1、细胞复苏：

从液氮罐中取出要复苏的细胞冻存管，迅速置于 37 ℃ 水浴锅中，轻微摇晃冻存管使细胞冻存管中的培养液快速融化（最好在 1 min 内完成），随后 1 000 rpm 离心 5 min，小心从离心机中取出细胞冻存管；

放入超净工作台中，弃去冻存管中的上清溶液，然后加入 1 mL 完全培养基（90% DMEM/F12+10% FBS），用移液器将细胞吹成单个细胞悬液，吹打时动作轻柔，将细胞悬液移转至无菌细胞培养皿，加入适量完全培养基，置于 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中培养。

2、细胞传代：

在显微镜下观察细胞的密度，细胞长至 80% 左右可以考虑传代，如细胞较稀，请及时换液。从 CO₂ 培养箱取出细胞培养皿，用移液枪吸弃去细胞培养皿中的陈旧培养基，使用事先预热至 37 ℃ 的 PBS 溶液洗涤细胞两次并弃去以消除血清对后续胰酶的中和作用的影响。

加入 1~2 mL 的胰酶消化细胞，轻微摇晃细胞培养皿，使得胰酶能完全浸润细胞表面，在显微镜下观察细胞（注意不同细胞的消化时间不同，放入 37 ℃ 培养箱可促进胰酶消化活性）；

待细胞回缩变圆、细胞间隙增大后（HK-2 细胞大概 1~2 min，注意尽量避免细胞大面积从培养皿底部脱落，防止消化过度），弃去胰酶，加入 1~2 mL 完全培养基终止消化，将细胞从培养皿表面吹下，轻柔吹打细胞形成单个细胞悬液，将细胞悬液混匀后分状至新的细胞培养皿，并加入适量完全培养基继续培养。

3、细胞冻存：

事先配好细胞冻存液（完全培养液 92%，DMSO 8%）。将处于对数期生长的细胞按照细胞传代步骤进行消化，将细胞吹打成单个细胞悬液后，收集细胞至 15 mL 离心管中，1 000 rpm 离心 5 min，弃去上清，加入上述细胞冻存液，使用移液器吹吸混匀后，加入无菌细胞冻存管中；

在冻存管上标注细胞名称及冻存时间后，4 ℃ 放置 1 h，-20 ℃ 放置 2 h，-80 ℃ 放置过夜后（也可将细胞放入常温的细胞冻存盒后，直接放入 -80 ℃ 冰箱过夜），置于液氮罐中长期保存，注意做好标记。

1、细胞操作都需在无菌条件下操作，严防污染。

2、HK-2 细胞对血清质量要求高，推荐使用优等胎牛血清。

3、在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，而在细胞冻存时，要逐步降温冻存或者放入细胞冻存盒中，遵循慢冻速溶原则

4、HK-2 细胞为上皮细胞样贴壁细胞，在甲基纤维素、软琼脂上不生长且不能悬浮培养。

5、HK-2 细胞生长缓慢并且需要一些时间才能贴壁。在培养基中看到许多圆形、漂浮和折射细胞是正常情况，不应丢弃松散附着和圆形的漂浮细胞，收集离心后可重新加入到培养皿中。

6、HK-2 细胞培养密度不宜过高，建议 80% 密度及时传代，2~3 天更换新鲜培养基，按 1:2 至 1:4 进行传代，使用 0.25% 胰酶消化 1~2 分钟。