传代细胞培养实验（基本方法一）

当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面培养基内的营养物不足和代谢物积累不利于细胞生长甚至发生中毒，如果不及时的减少细胞密度，细胞将逐渐衰老死亡。因此需要将培养物按照比例重新接种到新的培养器皿（瓶）内进行培养，这个过程就称为传代培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞的传代则用直接传代法或离心法传代。细胞种类不同，所需的培养基、添加剂以及传代培养的操作都会有所不同，可以参照 ATCC（美国模式培养物集存库．http://www.atcc. org）网站上列出的相关信息来操作细胞。

试剂：细胞 Hanks、胰蛋白酶 EDTA

仪器：培养液吸管、培养瓶

一、贴壁细胞：HeLa 细胞的传代培养 

1. 选取生长密度 80% 左右的 HeLa 细胞，在生物安全柜中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入 2 mL 的 D-Hanks 溶液，漂洗细胞以除去残留的血清。

 
2. 吸去培养皿中的 D-Hanks 溶液，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液，于 37 ℃ 消化 2～3 min（如消化程度不够，可延长时间)，倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆时，轻轻吸去酶消化液（如果有较多细胞漂起，需要直接加入完全培养基来终止胰蛋白酶的消化反应）。 

3. 加入 4 mL 完全培养基，用移液管反复吹打细胞成为细胞悬液。将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，1000 rpm 离心 5 min。 

4. 轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。 

5. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、本次传代日期和操作人，轻轻摇匀后转移到 CO₂ 培养箱中于 37 ℃ 培养。 

6. 细胞培养 24 h 后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理）。 

二、悬浮细胞或半贴壁细胞的传代培养：

悬浮细胞不贴壁（半贴壁细胞贴壁不紧），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具体过程如下： 

1. 取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞吹打均匀。 

2. 把细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，1000 rpm 离心 5 min。 

3. 轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。 

4. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、本次传代日期和操作人．轻轻摇匀后转移到 CO₂ 培养箱中于 37 ℃ 培养。 

5. 细胞培养 24 h 后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理）。

1. 把握发了传代时机，已如前述，在 80%~90% 汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。 

2. 消化时间要适度，过短细胞不易从瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。

3. 消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。

4. 各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。

5. 消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。