🔥 细胞冻存保种

细胞生长至对数中晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻。

市场上有多家成熟的无血清冻存液，这些试剂简单实用，极其便捷。对一些难复苏的细胞极其友好。但是对于长期的细胞留库保种还是建议采用传统的方法。

传统上的细胞冻存（甘油/二甲基亚砜做保护剂）讲求的是：慢冻速溶。细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜（DMSO），这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

细胞保种

【实验材料】

细胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA（或细胞刮刀）、100X 双抗、PBS、胎牛血清、DMEM 完全培养基、75% 乙醇、胰酶、异丙醇；

【仪器与用品】

冻存管、37 ℃ 恒温水浴锅、培养皿（6 cm）、细胞冻存盒（已添加异丙醇）或冻存泡沫盒、记号笔、-80 ℃ 冰箱、倒置相差显微镜、液氮罐、离心机、细胞房专用超净台、移液枪及移液枪头（无菌或灭菌后烘干）、一次性细胞计数板、细胞自动计数仪、培养箱、移液管。

1. 预先配制冻存液：按正常培养基:DMSO = 9:1 比列配制冻存液;

2. 取对数生长期细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，离心 1000 rpm，5 min；

3. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5×10⁶/mL～1×10⁷/mL；

4. 将细胞分装入冻存管中，每管 1～1.5 ml；

5. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间、细胞代数及操作者；

6. 往冻存盒中加入异丙醇（在负八十冰箱中能以 1 ℃/min 的速度下降）放入 -80 ℃ 冰箱即可，建议 12 小时以上。一般可在  -80℃ 中保存半年至一年，长期保存要转移至液氮中；商用冻存液可以直接冻存管放 -80 ℃ 冰箱。

1. 液氮冻存不建议用国产冻存管，复苏时容易爆管；

2. 消化细胞时，不能过度消化；

3. DMSO 溶于 DMEM 培养基会放热，应提前 5-10 分钟配置冻存液。用冻存盒时避免异丙醇将标记擦掉；

4. DMSO 能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套。因此，应谨慎处理。将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。

1. 细胞消化过度，导致复苏时细胞状态不好；

2. -80 ℃ 冰箱中长期保存细胞效果不好，应及时将细胞转移至液氮中；

3. 国产冻存管在液氮中容易漏液氮，导致复苏时曝管，所以放液氮中尽量使用质量较好的冻存管。