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Realtime（qPCR）实验进阶

专题72 内容 1194 订阅

核酸提取

核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。

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染色质免疫共沉淀测序（chip-seq）

染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前唯一研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法，主要包括 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 两种。利用 ChIP-seq 技术能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白修饰、转录因子等互作的 DNA 区段。

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SPSS 分析 qPCR 数据

qPCR 是一种相对表达定量的方法，real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。Real-time qPCR 因为其灵活的操作性、良好重复性等优点发展迅速。SPSS　(Statistical Product and Service Solutions) 是一个组合式软件包，它集数据录入、整理、分析功能于一身。2010 年被 IBM 并购 SPSS 统一更名为 IBM SPSS，每年 8 月更新版本。目前最新版本为 SPSS

操作方法所属实验：基于 SPSS 的数据资料整理与分析

低至单拷贝核酸 qPCR 方案

荧光定量 PCR 技术可以实现 RNA 的相对定量，广泛应用于分子生物学研究及疾病相关研究。QIAGEN QuantiNova PCR 系列可支持包括一步法、多重等多种 qPCR 应用；超快速的反应体系 30 min 即可完成实验及独特的颜色指示方案杜绝加样错误；LNA（锁核酸）技术加持增强引物或探针的灵敏度和特异性。

操作方法所属实验：微量样本核酸

问qpcr

土井挞克树

可能是有片段断裂才会出现这种情况

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问qpcr重复性不好

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qPCR 实验中遇到这 3 个问题怎么办？

荧光定量 PCR 的常见异常结果除了扩增曲线异常、融解曲线异常两类常见情况外，qPCR 实验中通常还会遇到以下三大类情况： 1. 复孔间重复性差怎么办？复孔间重复性差一般会有以下两种情况：（1）CT 值很大，如 CT≥ 30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的 CT 值差异较大。解决方法：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的 △CT 值为 3 or 5 以上，那 CT 值为准确的，可多设置

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qPCR常见问题及其分析

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用

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qPCR 问题全解析

专题54 内容 503 订阅

端粒显示实验

：Southern印迹法、Q-FISH法和qPCR法。

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实时定量 PCR 实验

实时定量 PCR( qPCR ) 于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司首先推出。传统 PCR 方法可对特定 DNA 片段进行指数级的扩增，并可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析，都属于对 PCR 反应终产物的检测。但很多情况下我们更需要确定的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强

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QPCR 法检测端粒长度

随着近年来 PCR 技术及流式细胞术的发展，实时定量 PCR（quantitativePCR，qPCR）技术及流式荧光原位杂交法（flow-fluorescence in situ hybridization，Flow- FISH）等操作相对简单、结果直观的方法也被用来显示端粒的长度。

操作方法所属实验：端粒显示实验

🔥 采用 qRT-PCR 检测细胞炎性因子

设计特异性的引物和荧光探针，以确保只扩增目标序列并减少假阳性的发生。可以使用在线工具（Primer3 等）设计合适的引物和荧光探针，也可以向商家购买。（4）若 SYBR Green 染料法，在 qPCR 反应体系中，需根据 PCR 仪器型号选择是否加入 ROX 染料。（5）数据分析：qRT-PCR 检测的结果需要通过数据分析软件进行处理。需要注意数据的标准化和统计学分析。同时，需要对实验结果进行验证和重复实验，以确保结果的可靠性。

操作方法所属实验：细胞因子检测

问qPCR扩增曲线是拱形的，为什么呀