核酸提取

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。

原理

DNA是遗传信息的载体 ,是最重要的生物信息">生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到：1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。核酸的提取关键是去除蛋白质，通常情况下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提，在单价阳离子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。作DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA及大约20μg/ml单链寡核苷酸。根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度。DNA及RNA纯品的OD260/OD280值分别是1.8和2.0，如果样品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280将明显低于此值，此时无法对样品中的核酸进行精确定量。

应用

核酸提取

来源：丁香实验

操作方法

核酸提取法

饱和氯化钠抽提法提取外周血 DNA 1．取 0.5ml 抗凝全血，加入 0.8ml TE(pH 8.0)混匀； 2．室温离心，10000rpm ，1分钟； 3．弃上清，加入 0.4ml TE(pH 8.0)，混匀，悬浮细胞； 4．加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（终浓度100μg/ml）,10% SDS 25μl(终浓度0.5%)，混匀； 5．37℃ 水浴消化过夜，或 50℃ 消化 4 小时；

核酸提取薄层培养

1. 将组织剪成1mm3左右的组织块；2. 用PBS缓冲液清洗组织块3次；3. 将组织块按照一定间距转入培养瓶内；4. 静置30分钟（使组织块更好的贴壁）；5. 每瓶加入2.0mL新鲜培养液（缓慢，防止组织块浮起），塞好瓶塞置37oC恒温培养箱内培养； 6. 根据培养液的颜色变化，更换培养液（每天进行细胞形态观测，细胞计数，测上清液PH值）。

密度梯度离心法（核酸提取）

1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单