密度梯度离心法（核酸提取）

【试剂】

比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。

【仪器，耗材】

短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。无菌干燥注射器针头、碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带、血球计数板、显微镜、水平式离心机。

1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。

5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。

1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。

2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。

3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。

4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。