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PCR 实验基础原理

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聚合酶链式反应

本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

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T4 DNA 聚合酶实验

T4 DNA 聚合酶具依赖人为模板的聚合酶活性，同时具有对单链、双链DNA的3’到5’端的外切酶活性，缺少5’到3’端的外切酶活性。

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聚合酶链式反应

一、材料1. 缓冲液与溶液10X 扩增缓冲液氯仿4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)2. 酶与缓冲液热稳定 DNA 聚合酶3. 凝胶聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶4. 核苷酸与寡聚核苷酸旁观者 DNA正向引物（20 μmol/L）及反向引物（20 μmol/L) 溶于水中模板 DNA5. 特殊设备自动微量移液器的屏蔽型枪头离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）正向排液式移液器6. PCR 仪二、方法1. 按以下次序，将各成分加在 0.5 ml 灭菌离心管、扩增

操作方法所属实验：聚合酶链式反应

T4 DNA聚合酶

一、50 μl 反应体积：（1）50 mmol/l Tris·Cl，pH8.0（2）5 mmol/l MgCl2（3）5mmol/l DTT（4）100 μmol/l 4dNTP混合液（5）50 μg/ml BSA（6）0.1 U T4DNA聚合酶（7）2 μg DNA（8）11℃温育20 min，加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。（9）反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。二、dNTp浓度的效应 1. 高浓度

操作方法所属实验：T4 DNA 聚合酶实验

问T7聚合酶必须反式提供?

土井挞克树

一般是指由反义RNA合成，与引物方向相反

实验问答2 回答431 围观

问请问有没有3*到5*的DNA聚合酶

土井挞克树

DNA聚合酶III这种酶既有5’→3’方向聚合酶活性，也有3’→5’核酸外切酶活性。该酶的活性较强，为DNA聚合酶Ⅰ的15倍，DNA聚合酶Ⅱ的300倍。他能在引物的3’-OH上以每分钟约5万个核苷酸的速度延长新的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。

实验问答1 回答382 围观

DNA聚合酶，你选对了吗？

PCR(Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应，对于常年狂奔在实验室的实验狗来说并不陌生。那么，对于 PCR 反应的核心成份，DNA 聚合酶，你选对了吗？常见的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根据耐热性来分可分为耐热酶和常温酶。耐热聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常温聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根据保真度来分，高保真聚合酶

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【转帖】聚合酶链式反应（PCR）

PCR扩增技术，即聚合酶链式反应，是美国科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。现在的PCR扩增不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 PCR扩增技术的基本原理 PCR扩增，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR反应由变性--退火

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聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术可用于：（1）检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；（2）有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；（3）临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

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沉淀 σ32 和 RNA 聚合酶实验

本实验介绍沉淀 σ32 和 RNA 聚合酶需聚乙烯亚胺的含量。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

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沉淀 σ32 和 RNA 聚合酶实验

材料与设备SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶（10%)试剂聚乙烯亚胺（PEI)(6% 储液，pH7.9)(配方，见“试剂的配制”，pp.184~189)操作程序1)0.2%DOC 上清 (见 p.153), 取 6x50-ul 等分试样。各试样分别加入 0、1、2、3、4 和 5ul 6%PEI 储液（使 PEI 浓度分别为 0%、0.12%,0.24%、0.36%、0.48% 和 0,6%), 充分混匀，孵育 5~10 min。2) 用微型离心机离心 1ml，离下沉淀物。如需要，取上清

操作方法所属实验：沉淀 σ32 和 RNA 聚合酶实验

小载体聚合酶链反应

PCR 缓冲液7μL无菌水8μL 2.5 mmol/L 4dNTP 混合物2.5 20μmol/L mTn 引物（步骤 2)2.5μL 20 pmol/L UV 引物（步骤 2)1μL (5 U) Taq DNA 聚合酶。7)将混合物转移到自动化热循环控制仪上92℃变性2 min。在以下条件下进行PCR反应20 s 92℃(变性)30 s 67℃(复性)45 s 72℃(延伸)90 s 72℃(延伸)8)从步骤7的反应混合物中取出80,用非变性琼脂糖凝胶电泳法进行分析应该可以看到一约含有200〜

操作方法所属实验：酵母菌基因组转座子的诱变实验

问重组酶聚合酶扩增

Dr_劉医生

高浓度质粒往往是不稳定的，而且质粒的扩增会占用大量资源，当载体用于表达或者其他用途时一般会用低浓度的

实验问答3 回答421 围观

问关于PCR实验中DNA聚合酶的问题？

Dr_劉医生

肯定会抑制扩增呀，酶加多了就会对扩增反应产生抑制作用。

实验问答3 回答840 围观

Nature：施一 / 高福团队揭示埃博拉病毒聚合酶工作的分子机制

也导致 3481 人感染，2299 人死亡。今年 9 月，非洲乌干达又再次出现新的埃博拉疫情。这些数据告诉我们，埃博拉疫情并没有完全结束，并时刻威胁着我们的生命健康，因此急需加强针对埃博拉病毒的科学研究。埃博拉病毒属于丝状病毒科，基因组为不分节段的负链 RNA，长约 19 kb，包含 7 个阅读框。病毒 RNA 基因组被核蛋白（NP）包裹，进一步与聚合酶蛋白（L），病毒辅助蛋白（VP35）和转录激活蛋白（VP30）结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）。在病毒粒子中 RNP 进一步与核衣壳相关

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聚合酶链式反应步骤、体系及问题分析

相关专题 聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用技术，是体外扩增DNA 的方法，设计生物学的各个领域，基本是进了实验室都必须掌握的技术。对于刚入生物门的我们简单了解其步骤、反应体系很有必要。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR )步骤三步： 1 变性：模板DNA加热变性 2 退火引物与它的靶序列发生退火，引物DNA量多

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反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

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聚合酶链反应构建重组 DNA

聚合酶链反应构建重组DNA用途广泛（1）用于测序引物（2）定点突变（3）核酸杂交探针（4）PCR引物。

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从 PEI 沉淀洗脱σ32 和 RNA 聚合酶实验

材料与设备SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶（10%)试剂缓冲液 A含 0、0.3、0.5、0.7、0.9 和 1.1mol/LNaCl 的缓冲液 A(配方，见“试剂的配制”，PP.184~189)操作程序1)PEI 悬液（见 p.153) 于离心前取 6X50ul 等分试样。各试样用微型离心机离心 lmin, 然后用 50ul 分别含 0、0.3、0.5、0.7、0.9 和 1.1mol/LNaCl 的缓冲液 A 重悬沉淀物。2) 充分混匀后静置 10~15mi。再用微型离心机离心

操作方法所属实验：从 PEI 沉淀洗脱 σ32 和 RNA 聚合酶实验