提取组织线粒体做western

操作步骤：

1.提取线粒体后，蛋白定量，与线粒体保存介质（主要成分蔗糖、Tris）混匀-20度冻存。

2.将分装线粒体取出融化后，加上样缓冲液混匀。

3.100度水浴5分钟，取出立即置于冰上。上样，每孔150微克蛋白。

4.5%浓缩胶，80伏电压，12%分离胶，110伏电压跑电泳。

在低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后获得线粒体，提取蛋白进行wb

从组织中提取线粒体进行Western blot分析的详细步骤如下:

1. 取新鲜组织样本,用预冷PBS缓冲液快速冲洗,除去血液等污染。

2. 切碎组织,加入适量的线粒体分离缓冲液,使用玻璃 homogenizer 进行组织匀浆。

3. 4°C、600g 条件下落差速率法分离细胞precipitate,去除细胞碎片。

4. 取上清,8,000g 高速离心10分钟,收集线粒体沉淀。

5. 重复步骤4,洗涤线粒体沉淀。

6. 加入RIPA裂解液,彻底裂解线粒体,释放线粒体蛋白。-20°C保存。

7. 取线粒体蛋白样本进行BCA蛋白定量。

8. 等量线粒体蛋白样本进行SDS-PAGE电泳分离。

9. 电转移至NC膜,5%BSA或脱脂奶粉室温封闭1小时。

10. 加一抗孵育过夜,二抗孵育1小时,ECL化学发光方法显影。

11. X线片曝光、扫描、结合软件分析目标蛋白的相对表达量。

这是从组织中提取线粒体进行Western blot的常规操作流程。需要注意提取过程中保持低温,防止线粒体蛋白降解。