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汤姆卜丽波
你要先明确你的目的片段大小然后选择合适的载体质粒,和内切酶,具体哪一步有问题可以细致的问,实在不行提供基因给公司让公司合成
huarenqiang5
主要考虑克隆位点选择的问题。建议首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析,列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点,所选择
的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位
点。双酶切时尽量选择酶切温度相同,buffer
一致,双酶切效率高的两个内切酶。
loveliufudan
一些建议:
1. 仔细复查克隆过程每一步,确保每一步操作准确无误。检查是否选对了载体,是否采用了正确的酶切位点等。
2. 查阅相关文献和实验方案,了解这一步可能遇到的问题及解决方法。比如是否需要改进转化效率,调整培养基成分等。
3. 修改实验方案,尝试使用其他载体或不同的克隆策略。有些情况下改变载体类型、使用不同的启动子等可以提高克隆效率。
sswei
1. 引物特异性不好,PCR杂带太多或根本扩增不出来
在CDS区的上下游重新选择引物,扩增成功后,以这个大一点的片段为模板扩增CDS区;
人基因ORF库购买。
2. PCR产物酶切不成功
构建克隆载体,再酶切;
载体自连会使Lac Z编码,在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。
3. 没有合适的酶切位点
无缝克隆试剂盒。
4. 没有合适的抗体
加上标签,翻译成融合蛋白,比如His、HA、Flag、Myc等,N端C端均可;
引物设计:CDS区序列,5’端依次加上标签序列、酶切位点和(或)保护碱基;
载体自带标签,需要注意酶切位点处可能移码。