3 个回答
loveliufudan
具体步骤：
新生鼠使用眼科剪将动物断头，并用镊子剥除头部的皮肤。在冰D-PBS液中沿颅骨人字缝从后向前剥离。一般左手持弯镊，在动物两眼处以适当力度固定；右手持直镊，完成剥除皮肤、骨骼以及分离组织等工作。在显微镜下利用精细器械分离皮层或海马时，沿皮层边缘以45°角小心划开，并逐步使之剥离，转移组织入盛有冰D-PBS液的35mm小皿中；然后用精细器械仔细去除每个皮层或海马的脑膜（整个过程需要在低温冰袋上完成）。
接着，进行组织的分散和单细胞悬液的制备。用管口较粗的弯头滴管吸去带有脑膜的D-PBS,尽最去除干净液体并避免吸走组织；用虹膜剪将组织逐撮均匀剪成乳糜状，使组织块为1mm3的大小为宜。加入合适体积的消化液（一般盖过组织块并且可以随意摇晃即可），并均匀分散组织，放入37°C孵育箱中消化约15min（每间隔3-5min用手轻轻摇晃1次，动物胎龄越小，越容易分散，消化时间可相应缩短）。消化液的选择可以根据不同的酶的效果和特点，一般推荐使用木瓜酶+DNA酶，因为这样可以提高细胞的存活率和分散效果。用弯头滴管将消化好的组织吸入含3-5ml冰的完全培养基的10ml离心管中，静置5min左右。用同样的滴管将沉底的组织转移到另一个含约5ml冰的完全培养基的10ml离心管中，并开始吹打。吹打时每次不超过15次，先用粗口径的弯头滴管吹散，静置片刻后将上清用细口径弯头滴管转移至另一个离心管中，并再吹打15次左右。在原先含沉淀的离心管中再加入完全培养基继续吹打，并收集上清重复上述过程。反复吹打几次后，组织块基本消失，将全部上清过200目筛网以去除剩余组织块并收集、计数。离心(900r/min, 5min)去除细胞碎片并将细胞重悬至合适的体积，以备后用。
最后，进行细胞接种和培养。培养皿需要经过特殊物质处理过，如多聚赖氨酸或层黏连蛋白等。培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况；换用阿糖胞苷培养液 (终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；每隔3d换全培养液1次，每次换半液。
土井挞克树
制备及培养步骤：
1．取出生后1-3天内的大鼠脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入Hanks液中漂洗1～2次后，置于30～50倍体积的Hank液中，脑组织比较柔软，反复吹打即可制成细胞悬液。
2．为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入离心管中，在室温直立5～10分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获得较多的细胞成分。
3．向末次沉淀物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5％CO2温箱中培养。
4．细胞生长汇合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做传代处理，加消化液的量以能覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离（平均5～10分钟），加入含有血清培养液，吹打制成细胞悬液。
sswei
需要将神经组织进行分离并获得神经元。常用的方法包括机械分离、酶消化和梯度离心等。
1. 机械分离：将神经组织放入含有离子平衡盐水的培养皿中，用细胞刮刀或剪刀等工具进行机械分离，剪成小块后用胶体离心分离神经元。
2. 酶消化：将神经组织放入含有胰酶和DNA酶的消化液中，使细胞间连接断裂，再用胶体离心进行分离。
3. 梯度离心：将分子量不同的离子浓度梯度制备在离心管中，将神经组织放入离心管中，离心分离获得神经元。
神经元原代细胞培养需要注意以下几个方面：
1. 培养基：小鼠神经元原代细胞常用的培养基包括DMEM/F12、Neurobasal、B27和Glutamax等。可以根据实验需要添加不同的生长因子和细胞因子。
2. 细胞密度：小鼠神经元原代细胞的细胞密度需要根据实验需要进行调整。通常可以在24孔或96孔培养板中进行培养，细胞密度为1-5×10^5/ml。
3. 培养条件：小鼠神经元原代细胞的培养条件需要注意保持恒定的CO2浓度和温度，以及适当的湿度。通常CO2浓度为5%，温度为37℃，湿度需要保持在80%以上。
4. 培养时间：小鼠神经元原代细胞的培养时间需要根据实验需要进行调整。通常可以进行长期培养，从数天到数周不等。
综上所述，小鼠神经元原代细胞培养是研究神经生物学和神经疾病等方面的重要手段之一。在进行培养时需要注意细胞来源、细胞分离、细胞培养和实验应用等方面的问题，以保证实验结果的准确性和可靠性。
