春风十里WW
于小鱼鱼1998
1.接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不一致。3.将培养板置于培养箱中预培养(37℃,5% CO2)12-24小时,使细胞达到指数期(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
每孔加入10ul CCK-8试剂
①由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议直接配置含10% CCK-8培养基(现用现配)以换液的形式加入。注意加CCK-8试剂时不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数。加CCK-8试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留,加入CCK-8试剂后轻轻震培养板。
②加CCK-8试剂时间可分别在22h、46h、70h、94h时加入,也可以在24h、48h、72h、96h时再加入。重要的是需保证实验组和对照组在同一时间点进行实验。
③若细胞培养时间较长,培养基颜色或 pH 发生变化,建议更换培养基后再加 CCK-8。5.将培养板置于培养箱内继续培养0.5-4小时①
sswei
对于悬浮细胞在加入CCK-8培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再确定;
加CCK-8试剂时,斜贴着培养壁加,不要插到培养基液面下,容易产生气泡,会干扰O.D值读数;
为使CCK-8试剂和培养基充分混匀,建议在加入CCK-8试剂后轻轻振摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8试剂在枪头上的残留所带来的误差,可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样;
如果待测物质有还原性,就会和CCK-8试剂发生显示反应,增加吸光度,如果药物有氧化性则降低吸光度。请检查背景的OD值,即在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加CCK-8试剂),如果OD值明显偏高,则说明有反应,也可以在加CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物影响。
加入待测物质的浓度需要多参考文献,选择合适的浓度梯度进行筛选。
尽量使用多通道移液器,可以减少平行孔间差异。
如果样品为高浑浊度的细胞悬液,可以设定600nm作为参比波长,扣除参比波长的OD值。
毛利小五郎的徒弟
1.取10ul CCK-8溶液加入96孔细胞培养板,在37℃培养箱中继续孵育0.5-4小时。
2.测定吸光度。建议采用双波长进行测定,检测波长430-490nm,参比波长600-650nm,或者采用450nm单波长检测。