cck8实验，测OD值前更换培养液（原培养液中有还原性物质），需要用PBS清洗几次？怎么轻缓冲洗？

用pbs洗一次即可，加入pbs后挺轻晃动培养板就行

检测步骤：

1. 细胞计数

对消化下来的细胞悬液进行细胞计数，一般计数2-3次取平均。

2. 细胞铺板

根据 预接种细胞数量+ 细胞计数结果调整细胞浓度，铺96孔板（加样均匀），每孔100μL，将铺好细胞（对数期）的96孔板放入37℃培养箱培养。

铺板注意事项：

(1) 铺板要混匀：

a) 可以先往孔里加50μL培养基，再接种50μL细胞悬液；

b) 不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下；

c) 铺完板后，还可以轻敲板底，帮助细胞分散均匀。或者用振荡器摇板帮助细胞分散。

(2) 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数

(3) 每次测定都需要在同一块板上设置调零孔。

(4) 培养板周围一圈孔容易蒸发，为了减少误差，培养板的四周只加无菌PBS，而不作为指标检测孔。

(5) 加液时，枪尖贴着孔内壁慢慢加，避免出现气泡，它们会影响OD值的读数。

3. 细胞处理

4-6h后观察到细胞贴壁后（细胞系快，原代慢），开始造模+操作分子+治疗药物等相应处理。

4、加入CCK-8

有三种做法：

(1) 直接往培养液加入10μL的CCK-8；

(2) 吸掉旧培养液，不加PBS清洗，再加入新配好的CCK-8；

(3) 吸掉旧培养液，PBS洗一遍，再加入新配好的CCK-8。

推荐做法：处理完毕后到达0、1、2、3、4、5天，吸掉旧培养液，每孔加入10μL CCK-8+100μL培养基（按每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液，配mix混合液，多配一孔，不要有气泡），继续培养2.5-3h左右。

5. 酶标仪检测

6.数据处理

初始细胞2000是可以的，需要用pbs洗至少三次