流式分选仪分选并收集带有绿色荧光标记的细胞

以下是需要注意的地方

（1）如何提高分选速度：

振荡频率、鞘液压力、喷嘴大小、上样速度

-振荡频率越高，分选速度越快；

-振荡频率越高，鞘液压力也随之增加；

-若要形成稳定液滴，最佳振荡频率：f=V/（4.5d）；

-鞘液压力和喷嘴大小一定时，振荡频率相对固定。

-上样速度过快，得率会降低，故最佳上样速度=1/undefinedf

（2）如何提高分选纯度：

-精确设定液滴延迟时间（Drop Delay）：指细胞通过激光检测区到液滴分离断电位置的间隔时间。

-保证液流稳定：鞘液和样品流进入喷嘴后，在电磁传感器产生的高频振荡下，形成稳定的液滴，即液流的断点位置维持在一个固定的位置。

-选择合适的分选模式

-排除样本粘连

-合理设门（用散点图）

-合理阈值设定

（3）如何提高分选得率：

- Drop Delay液滴延迟时间要准确，液流稳定

-如果不考虑纯度的情况下（不需后续培养），可以选择Enrich/yield分选模式

（4）如何提高分选活性

-与细胞本身的活性有关

-与仪器洁净程度有关

-与鞘液压力、喷嘴大小有关（对于脆弱细胞，尽量采用低压和大喷嘴，包裹细胞的液滴越大，对细胞的冲击越小）

-与上样管路设计及管壁光滑程度有关

以下是一些建议和注意事项：

1. 前处理：

• 确保细胞培养物的健康状态和纯度，避免细胞凋亡和细菌/真菌污染。

• 选择适当的细胞培养基和培养条件，以保持细胞的生长和表达目标荧光蛋白。

• 确定荧光蛋白的表达时间点和转染效率，以确保选择合适的时间点进行分选。

2. 无菌操作：

• 在进行流式分选之前，确保所有实验器具、培养皿、培养基、缓冲液等都是无菌的。

• 在分选操作过程中，使用无菌的器具（如离心管、移液器、离心机盖等），并在无菌条件下进行操作，如在层流柜或无菌工作台中进行。

3. 上机分选前的准备：

• 准备细胞悬液，确保细胞悬液中含有足够数量的荧光标记的细胞。

• 准备适当的流式细胞仪设备，并进行仪器校准和标定，以确保准确的荧光信号检测和分选。

• 预先选择合适的筛选参数和门控设置，以区分目标细胞群和非目标细胞群。

4. 分选收集过程：

• 在进行分选之前，对流式细胞仪进行有效的消毒和清洁，以防止交叉污染。

• 将细胞分选设为无菌模式，通过使用过滤器和UV辐射消毒样品线路和喷嘴来最大程度地减少细菌/真菌污染。

• 设置适当的收集管和介质，以确保细胞得到合适的处理和保持其生活状态。

5. 后续细胞培养：

• 收集的细胞应立即转移到无菌的培养皿或培养板中，用适当的培养基继续培养。

• 维持适当的温度、湿度和CO2浓度，以确保细胞的正常生长和代谢。

• 监测细胞的生长状态和健康状况，确保它们适合后续的实验需求。

后续还要做实验的话要注意无菌。

1、 准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。

2、 房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。