带有GFP的质膜蛋白分选观察
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1.了解绿色荧光蛋白和共聚焦扫描显微镜在细胞分子生物学中的应用
2.学会使用质膜蛋白的分析软件。
二、带GFP的质膜蛋白分选概述
1．质膜蛋白的跨膜信号
在粗面内质网上合成的蛋白质有两类：分泌蛋白和膜蛋白，分泌蛋白在内质网上合成之后通过多种信号切除后释放到内质网的腔中，进行下游途径的转运。膜蛋白较为复杂，它要靠疏水区滞留在内质网膜上。下面以酵母二价铁的转运蛋白（IRT）为例来说明膜蛋白的转运。IRT除了含有信号肽（也称开始转移序列 ‘start transfer sequence’是引导和启动肽链穿过内质网膜的信号肽)以外，还有八个跨膜结构域，这里有一个定向问题，即羧基端和氨基端位于内质网的内侧还是外侧问题。经TMpred和TMHMM预测的IRT的跨膜螺旋结构域，发现它的羧基端和氨基端均位于质膜的外侧。这样推测IRT在粗面内质网共翻译和转运时，羧基端和氨基端均位于内质网的内侧。推测IRT除了开始转移序列外，还有四个内部起始转移信号（internal signal sequence）启动多肽链的转移和四个终止转移序列 (stope transfer sequence)。终止转移序列可能有某些序列与内质网膜有很强的亲和力，紧密结合在膜脂双层中而不再转入内质网腔中。内部起始序列和终止转移序列都不被切除，整个多肽链作为穿膜八次的跨膜蛋白定位在膜中。
总结如下 ①一种多肽只有N端信号肽序列（或称开始转移序列）, 无停止序列T此蛋白合成后进入内质网腔中；②多肽的内部起始序列和终止转移序列位于分子中部，而且不被切除T 跨膜蛋白；③含多个内部起始序列和多个终止转移序列 T多次跨膜的膜蛋白。
2． GFP的特性
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一种能够自身催化形成发色结构，并在蓝光或紫外光的激发下发出荧光的新型报告基因。GFP的发现及其研究迅速发展，使人们能够在正常生活条件下对活细胞内分子水平上进行的各种过程及其分子机理进行观察和研究。目前的研究表明，GFP能在多种生物，如细菌，酵母，植物及哺乳动物中表达且产生可见荧光,因此有着很高的应用价值。GFP之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色团结构，即第65-67位氨基酸Ser-Tyr-Gly链，它们可自身环化在氧气的参与下与周围其它三个氨基酸形成六肽生色团。晶体结构分析表明，GFP分子为致密管状，由周围11个β-折叠片围绕中央一个α-螺旋构成，其生色团即包含在该中央α-螺旋结构中。GFP蛋白非常稳定，其光谱特性一般不受变性溶液的影响。
所以它用于生物技术的许多方面具备以下优点：
①GFP发出荧光不需要外加任何底物或共作用因子，仅用蓝光或紫外光照射即可激发荧光，所以检测非常方便，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可以实现。
②GFP荧光稳定且没有物种特异性，在原核、酵母、植物以及动物细胞中都获得了成功表达。
③GFP基因序列较短，可以与其它基因一起构建到载体上进行转化而不致于因为质粒过大而影响转化频率。
④GFP基因的表达产物对生活细胞基本上没有毒害作用，不会影响细胞的正常生长及功能。
