培养增多人的软骨细胞具体操作方法及步骤

具体操作步骤如下：

1．无菌条件下取材（术中切除的全层软骨片），于含无血清的DMEM培养液的无菌容器中保存，低温下转移（冰盒），移入超净工作台，PBS冲洗3次。剪去非软骨组织如滑膜组织或纤维结缔组织。

2．收集全部软骨，移入50ml离心管中。用10mlPBS洗软骨组织碎块2－3遍。在离心管内再加入新鲜的0.25％的胰蛋白酶（10ml/g），37培养箱中消化30－45min（最好在搅伴状态下），以除去可能附着的成纤维细胞。加入等量的10％DMEM终止消化，吹打后去除胰蛋白酶和成纤维细胞，再各用10mlPBS清洗两遍。

3．将软骨移入培养皿，倒入PBS淹盖标本为止，用无菌刀片将软骨片切成1mm3大小的碎粒，移入第二个50ml离心管中，PBS淹盖，冲洗3次。（标本要稍多一点，至少大于300mg试验取1g左右，软骨块要尽量切碎，便于消化）

4．加入5ml的0.2％的II型胶原酶，37培养箱中消化4-6h,其中2h后每隔20min晃动离心管一次，观察软骨块基本被消化，悬液变混浊。（II型胶原酶消化4-6h见悬液变混浊，表明已有软骨细胞消化下来，可先收集，未消化完的的软骨碎粒可继续消化，0.1％的II型胶原酶过夜约18－24h）

5．120目滤器过滤收集悬液（用PBS冲洗滤器底和皿底尽可能收集所有细胞），彻底打匀成团的细胞。

6．1000r/min离心10min，弃上清液，PBS重悬3次，相同条件再离心，弃上清液去除胶原酶，收集细胞。

7．加入10％DMEM培养液1ml，吹打均匀后移入10cm培养皿中，补足培养液至10ml。（吹打后可行计数板计数及台盼兰活性检测，或以2.5x104/cm2的比例置于培养皿中。）

8．48h后首次换液去除未贴壁的细胞。

9．置于37 5％CO2培养箱内继续培养，每隔3－4d换液1次，倒置显微镜下观察拍照。

10．细胞长满近融合时用0.05%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化2－3min，1200r/min离心5min，弃上清液，计数，按1：3或1：4传代。（推荐1：2传代）如果组织量多，可重复4－8步骤。

去除软肯表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1-3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分钟，PBS浸洗2遍；置于50ml玻璃培养瓶，加0.1％Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，待细胞贴壁达到85％－90％后传代。传代时,吸干培养液,用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25％胰蛋白酶－0.01％EDTA（1比1）消化液,以覆满瓶底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化,收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养瓶底壁脱落,收集细胞混和液, 1200r/min离心7分钟, 弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次,制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％，调整细胞浓度为5×107/ml,用于实验。吸干培养液,用PBS 液轻洗细胞2次,培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大,少部分细胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养皿底壁脱落,收集细胞混和液,离心,用PBS 液漂洗2 次,再制成细胞悬液,计数,检查细胞活力,按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。

当涉及到软骨细胞的具体培养方法时，以下是详细的步骤和操作：

1. 细胞准备：

- 从合适的来源（如人体骨骼或软骨组织）获得样本，通常需要手术或解剖获取。

- 将组织样本转移到含有生理盐水（PBS）的培养皿中，以保持组织的湿润。

2. 细胞分离：

- 用刀片或剪刀小心地将组织切割成小块，以增加细胞表面积。

- 将组织块置于含有消化酶（如胶原酶、DNA酶）的消化液中，通常在37摄氏度下进行消化。

- 定期轻轻摇动培养皿，帮助酶消化组织，并将细胞分散到消化液中。

- 使用细胞营养液（如DMEM/F-12）停止酶的作用，并过滤细胞悬浮液以去除组织碎片和残留酶。

3. 细胞培养：

- 将分离出的软骨细胞悬浮液转移到含有培养基和细胞营养液的培养皿中。

- 培养基通常包含基础培养基（如DMEM/F-12）和补充物，如胎牛血清（FBS）和抗生素（如青霉素和链霉素）。

- 根据需要添加生长因子（如胰岛素样生长因子、基本纤维生长因子）来促进细胞增殖和分化。

4. 细胞增殖：

- 将培养皿放置在细胞培养箱中，维持适当的环境条件（如37摄氏度、5%二氧化碳）。

- 培养皿可以放置在培养箱内的培养架上，以提供更大的表面积和更好的气体交换。

- 定期更换培养基，通常每2-3天更换一次，以提供足够的营养物质和移除代谢产物。

5. 细胞分化：

• 根据实验需求，可以使用特定的培养条件来促使软骨细胞分化为特定类型的细胞，如软骨细胞或软骨样细胞。

• 这可能涉及添加特定的细胞生长因子、激素或其他化学物质，以模拟体内的分化环境。

6. 细胞检测和分析：

• 使用显微镜观察和检查培养的软骨细胞形态和生长情况。

• 可以使用染色技术（如甲苯胺蓝染色）来识别和区分不同类型的细胞。

• 使用分子生物学技术（如PCR、免疫染色）来分析软骨细胞的基因表达和蛋白质水平。