（共享）免疫印迹具体操作步骤

免疫印迹所需仪器：
电转移装置、电源装置（200v，0.6A）、3MM Whatman 滤纸、2.0或0.45um孔径大小的硝酸纤维素膜(应储存在低温干燥处，操作时应戴手套以免膜被污染。)、塑料袋（Seal—A—Meal）、塑料或玻璃容器（15cm×10cm×2cm）、摇床、浅盘（30cm×15cm×3cm）、磁力搅拌器。
操作步骤：
准备工作：配制1L转移缓冲液并冷却至4度，冷却装置中加入双蒸水，冰冻过夜。用双蒸水清洗缓冲液池；插入转移电极，在缓冲液池中放入搅拌子，池中加一半缓冲液（约400ml）；插入冷却装置。
转移缓冲液配方：
a、 从SDS-PAGE到NC的转移通常采用Towbin等的方法：25mmol/L Tris， 192mmol/L 甘氨酸，pH8.3， 20%甲醇。
b、 转印缓冲液2（蛋白质<80kDa）的配制（1000ml浓度）：Tris碱 25mmol/L 3.0g；甘氨酸 190mmol/L 14.5g； 甲醇 20% 200ml；蒸馏水加至1000ml；
c、 蛋白质技术手册：（转移缓冲液：1.93g Tris 15.6mmol/L; 9g 甘氨酸 120mmol/L,加双蒸水至1L，不加调整时pH应为8.1～8.4;也可配成20×储存液。）将硝酸纤维素膜浸泡在转移缓冲液（30---40min）中15---20min；
1、 将凝胶切成所需大小用于转印。除去无关凝胶和未使用的凝胶泳道。将凝胶做好标记以确定第一条泳道的去向（一般是剪去凝较底部左手边角即可）。在准备滤纸时，将凝胶放入转印缓冲液中。
2、 剪取一张硝酸纤维素漠和4张吸水纸（Whatman 3MM），使其大小与凝胶相同。操作时戴手套并使用新的硝酸纤维素膜。
3、 将硝酸纤维素膜浸入蒸馏水中。通常是小心地将硝酸纤维素膜放在水面上使其浸湿。通过毛细管作用从底部开始浸湿硝酸纤维素膜（数分钟），然后将膜浸入水中2min。再放入转印缓冲液中5min。将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿。
4、 将凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸和支持垫浸入缓冲液中并保证其完全浸泡。小心地将支持垫中的气泡赶出（在转印缓冲液中完成组 装可确保夹层组合内不会再有气泡。）
5、 将转印夹层组合进行安装，使所有的部分保持湿润，务必使凝胶和滤纸之间接触良好。具体操作见下面步骤：
6、 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的3MM Whatman 滤纸；
7、 小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套）
8、 以转移缓冲液湿润胶面，小心将硝酸纤维素膜放在胶面上（从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或用镊子接触膜）；
9、 在硝酸纤维素膜上放一张浸湿的3MM Whatman 滤纸，用一张干净的小试管轻轻滚过凝胶—膜“三明治”以消除所有气泡；
10、 将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶—膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移池；将转印夹层组合放入转印槽中，硝酸纤维素膜紧靠正极（阳极，红色电极）。
11、 转移池中注满转移缓冲液。
12、 电转移：将整个转移装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌；连接好电极；恒压100v转移1h。对冷却的转移缓冲液，开始时电流应为0.2A,最终电流为0.4A.若转移过夜则恒压30v。
13、 (转移所需时间至少90min，或过夜。转移前最好电泳两块胶板，一块直接染色，另一块进行免疫印迹。)转印4---18h。较厚的凝胶和分子质量较大的蛋白质需要较长的转印时间，可对下述条件进行优化使分子质量范围很广泛的蛋白质都得到转印。对于15×15×0.1cm大小的凝胶,分子质量超过100kDa的蛋白质,可先用28v转印1h,然后于84v转印14---16h.若蛋白质的分子质量低于上述,则以63v转印4---16h即可。在转移过程中，温度会明显升高。因此，需要使用冷却管或在低温室内进行转印以避免在夹层组合中产生气泡。
14、 转印结束后立即断开电源。小心拆开装置。在膜上做好标记（一般剪取底部左手边角，并定位第一泳道）。
15、 用考马思亮蓝对凝胶进行染色或银染以验证转印物。硝酸纤维素膜经过适当处理后进行染色或封闭。
16、 丽春红S印迹膜染色：
所需试剂：2%丽春红S溶于30%三氯醋酸；30%磺基水杨酸；PBS；
操作步骤：
a、 在染色之前，先配制丽春红S的浓贮存液。即2%丽春红S溶于30%三氯醋酸和30%磺基水杨酸中。将该液用水1：10稀释即成为应用液。
b、 用丽春红S使用液将硝酸纤维素膜洗一次。
c、 加入新鲜稀释的丽春红S应用液，并在室温下搅动5—10min。
d、 将硝酸纤维素膜放入PBS中漂洗数次，每次1—2min，并更换PBS。
e、 根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记。
17、 印迹膜的封闭：
所需溶液和试剂：PBS； 3%BSA/PBS； 封闭液； 一抗溶液； 标记的二抗试剂；
操作步骤：1）拆卸转移装置，将滤纸揭下；2）用镊子或戴手套将膜放入容器中；用PBS漂洗印记膜数次3）加入至少8mlBSA/TBS溶液（液面须没过膜）；4）轻摇30---80min，注意保证膜的所有部分同溶液接触。根据蛋白质稳定性的差别，封闭后的膜可在含1mmol/L NaN3的BSA/TBS中保存过夜或数天。//室温下搅动孵育。一般孵育20min—2h 较好。（若是用小的印记膜条，每条可以放在1支试管中。最好是用顶部可封口的5ml试管。15×0.5cm的印记膜条用0.5ml的试管即可。）
18、 封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS清洗2次，每次5min；///洗膜：弃去封闭液，用TBS洗膜三次；
19、 一抗：1）弃去TBS，将一抗适当稀释于8ml 0.5%BSA/TBS中；为节省封闭液可将膜放置于塑料袋中操作。对于6cm×8cm的膜可加入4ml封闭液即可，注意一定要完全去除气泡，否则气泡阻止抗体—蛋白质相互作用，造成假阴性结果。2）温和摇动至少1h，过夜孵育可增加灵敏度。或者如下：
加入一抗溶液。每张15×15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如3%BSA/PBS。孵育可在浅盘中进行。适用组织培养上清可以不稀释或1：10稀释。得到的抗体浓度为1---50ug/ml。抗血清、腹水或纯化抗体的最终浓度也应在此范围内。一般将10ul稀释成10ml已足够。假如抗体的浓度尚未知，应试做若干稀释以确定最适范围。
20、 在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有实验者报告孵育过夜（12—18h）可提高灵敏度。
21、 用PBS清洗印迹膜4次，每次换液洗5min。或者：洗膜I：弃去一抗，用TBS洗两次，每次10min。
22、 此时，印迹膜便可加入标记的二抗。若检测完整的印迹膜，可在浅盘中孵育。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如3%BSA/PBS。商品化的酶标二抗应在5---0.5ug/ml浓度之间使用（通常将商品试剂原液稀释成1：200---1：2000的应用液）。用辣跟过氧化物酶标记的试剂需用不含叠氮钠的封闭液稀释。或者：二抗：1）弃去TBS；2）加入8ml适当稀释于0.5%BSA/TBS中的二抗；3）温和摇动至少1h或过夜。
23、 室温下搅动孵育1h。
24、 用PBS清洗印迹膜4次，每次换液洗5min。或者：洗膜II：弃去二抗，用TBS洗膜30min，共洗三次。（若一抗孵育时使用塑料袋，则现在应将膜移入玻璃或塑料容器中）
25、 显色：1）配制显色液：1ml氯萘酚溶液（30mg/ml于甲醇中）加入10ml甲醇，加入TBS（室温）至50ml，加入30ulH2O2；2）弃去TBS，加入显色液；3）轻摇硝酸纤维素膜，观察显色程度；4）若出现大量沉淀，请使用新鲜配制的显色液；5）显色应在5—30min内完成；6）用双蒸水洗膜终止显色反应，每次30min，共三次；7）用吸水纸吸干膜上水分，避光干燥保存（可放于塑料袋内夹在本中）；8）一周内照相，否则信号将随时间延长而退色，膜逐渐变黄。