3’5’race具体操作步骤与原理

3′RACE

RACE的实验样本包括总RNA，poly(A)+RNA等。首先根据mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA链。根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)合成第二条cDNA链。随后以基因特异性引物(GSP)及正义链3′末端引物作为一对引物，对得到的cDNA链进行PCR扩增，从而得到cDNA的3′端序列（基因特异性引物→3′末端）

5′RACE

根据已知的cDNA序列设计基因特异引物(GSP)，逆转录获得第一条cDNA链，同时用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在cDNA3′端加Poly(C)尾。依据Poly(C)尾设计特定引物合成第二条cDNA链。随后以第二条cDNA链为模板利用基因特异性引物合成双链cDNA。最后以基因特异性引物(GSP)及反义链3′末端引物为一对引物进行PCR扩增获得cDNA5′端序列（基因特异性引物→5′

先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。