RACE技术的原理和操作

 

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的Maratho^TM 技术和SMART^TM RACE技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon^TM 所得到的片断总是比采用SMART^TM RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon^TM 技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMART^TM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART^TM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。

SMART^TM 3'-RACE的原理

利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。（见Figure 1）

Figure 1.

SMART^TM 5'-RACE的原理

先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见Figure 2 ）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。

Figure 2.

实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为：

第一，在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤（反转录、同聚物加尾和PCR扩增），每一步都可能导致失败；

第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。

随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。

RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法

1. 反转录（RT）反应。

2. Hybrid RNA的分解。

3. 单链cDNA的自身连接。

4. PCR扩增5'未知区域。

5. 目的DNA片段的切胶回收。

6. DNA序列测定。

原理见Figure 3。

Figure 3.