RACE 实验

cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于逆转录 PCR从低丰度的转录本中快速扩增 cDNA 的 5' 和 3’ 末端的有效方法。

cDNA 3’ 端通常含有调控 mRNA 稳定性或亚细胞定位的信号，5‘ 端非翻译区编码含有mRNA 稳定性、亚细胞定位或翻译效率相关的结构信息，而在某些情况下 cDNA 末端序列可能缺失，而 RACE 可以先通过反转录获得 cDNA 后再通过特异引物向末端延伸从而快速获得缺失的末端序列。

3’RACE：根据 mRNA 3′ 末端天然存在的 Poly(A) 尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA 链；根据已知的 cDNA 序列设计基因特异性引物（GSP）合成第二条 cDNA 链；随后以基因特异性引物(GSP)及正义链 3′ 末端引物作为一对引物，对得到的 cDNA 链进行 PCR扩增，从而得到 cDNA 的 3′ 端序列。

5’RACE：根据已知的 cDNA 序列设计基因特异引物(GSP)，逆转录获得 cDNA 链，同时用末端脱氧核苷酸转移酶在合成的 cDNA 3′ 端加 Poly(C) 尾，得到拥有 Poly(C) 尾巴的第一条cDNA 链；依据 Poly(C) 尾设计特定引物 Poly（A）合成第二条 cDNA 链。随后以第二条cDNA 链为模板利用基因特异性引物合成双链 cDNA。最后以基因特异性引物(GSP)及反义链3′末端引物为一对引物进行 PCR 扩增获得 cDNA 5′ 端序列。

现在，有很多对 RACE 技术的不同改进方法，适用于不同情况，如将 RACE 与巢式 PCR 结合，提高产物特异性等。

需要得知 cDNA 两端序列信息时，或仅利用 poly(A) 尾无法获得全长 cDNA 时，可使用 RACE技术快速且特异性的获得 cDNA 全长序列。

仪器：

PCR 热循环仪，凝胶电泳成像仪，电泳仪，离心机

试剂：

1. RNA（经过电泳验证完整性），其中 3’RACE 优先选用具有 Poly（A）的 RNA；

2.dNTP溶液（包含四种 dNTPs，每种为 10mM）、0.1MDTT，5x 反转录缓冲液、RNA 酶H、RNA 酶抑制剂、SuperScript II 逆转录酶、10xHercules 热启动聚合酶，Tris–EDTA 溶液 （10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA pH 8.0）；以下为 5’RACE 所特需：25mM Cocl2 ，1mM 的 dATP 溶液，末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt），5x 末端转移缓冲液（125mM Tris-HCl，pH6.6，1M二甲胂酸钾，1.25mg/mL BSA）

3.引物（均为5’-3’）:
QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGAC TCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT
Q0 ：CCAGTGAGCAGAGTGACG
QI：GAGGACTCGAGCTCAAGC
GSP1 和 GSP2：3’RACE 根据目标已知序列 5‘ 端设计特异性引物，5’RACE 根据目标已知序列 3‘ 端设计特异性引物。在此处引入两对引物扩增两次，能够提高终产物的特异性。

实验步骤分为 3’ 和 5’ 两部分

一、3’RACE
1. 反转录生成 cDNA 模板

（1）配制反转录混合液：
以 20uL 反转录终体系为例，将各组分混合于离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x 反转录缓冲液，1.3mM dNTP 溶液，12.9 mM DTT，50ng QT 引物，10 U RNA 酶抑制剂；

（2）新取一离心管，加入 1ug Poly（A）RNA 或 5ug 总 RNA，加 ddH2O 补足至11.25uL，80°C 加热 3min 后，立即置于冰上迅速冷却，10000g 4°C 离心 5 sec；

（3）将第（2）步处理后的 RNA 加入到第（1）步配制的反转录混合液中使总体积为 20uL，加入 200 U SuperScript II 逆转录酶，在室温(22-25°C)下混合后静置 5 min，然后42°C 加热 1 h，50°C 加热 10 min；而后 70°C 加热 15min 终止反应，离心机最高速室温瞬离 5 sec；

（4）加入 1.5 U RNA 酶 H 后 37°C 孵育 20 min 以降解 RNA 模板；

（5）加入 Tris-EDTA 溶液将反应混合物稀释至 1mL 得到 cDNA 模板溶液，保存于 4°C，禁止冻融。

2. 第一条 cDNA 链的合成

（1）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP 溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；

（2）加入 1uL cDNA 模板溶液以及引物 GSP1 和 Q0 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管，以确定阳性信号来源于 cDNA；

（3）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性， GSP1 的 Tm 值温度 2min，72°C 40 min 延伸；

（4）进行循环：94°C 10 sec，GSP1 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第一条 cDNA 链产物溶液。

3.第二条 cDNA 链的合成

（1）将第一条 cDNA 链产物溶液用 Tris-EDTA 溶液稀释 20 倍；

（2）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；

（3）取 1uL 稀释后的第一条 cDNA 链产物溶液，加入引物 GSP2 和 Q1 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管；

（4）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性；

（5）进行循环：94°C 10 sec，GSP2 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第二条 cDNA 链产物溶液。

4.产物分析

使用凝胶电泳分析最终的PCR产物，对cDNA鉴定可通过杂交或测序。

二、5’RACE

1. 反转录生成 cDNA 模板

（1）配制反转录混合液：
以 20uL 反转录终体系为例，将各组分混合于离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x 反转录缓冲液，1.43mM dNTP 溶液，2.88mM DTT；

（2）新取一离心管，加入 50ng GSP-RT 引物，1ug Poly（A）RNA 或 5ug 总 RNA，加ddH2O 补足至 12uL，80°C 加热 3min 后，立即置于冰上迅速冷却，10000g 室温离心 5 sec；

（3）将第（2）步处理后的RNA加入到第（1）步配制的反转录混合液中共 20uL，加入 200 U SuperScript II 逆转录酶，轻柔混合后 42°C 加热 1 h，50°C 加热 10 min；而后 70°C 加热 15min 终止反应，离心机最高速室温瞬离 5 sec；

（4）加入 1.5 U RNA 酶 H 后 37°C 孵育 20 min 以降解 RNA 模板；

（5）加入 Tris-EDTA 溶液将反应混合物稀释至 400uL 得到 5’ 端无尾 cDNA 溶液，保存于4°C，禁止冻融。

2. 第一链 cDNA 的 Poly（A）加尾

（1）使用 QIAquick 过滤器产品说明书或其他等效产品除去5’端无尾 cDNA 溶液中多余的引物，最终体积不应超过 15uL，不足的用 ddH2O 补足至 15uL，

（2）加入 4uL 加入 5x 末端转移缓冲液4 uL， CoCl2 1.2 uL，dATP 4 uL， Tdt 10 U。同时设置一个用等量蒸馏水替代 Tdt 的阴性对照反应管；

（3）放入 PCR仪，37°C 5 min，65°C 5min，再用 Tris-EDTA 溶液稀释至 500uL，得到5’端 cDNA 溶液，保存于 4°C；

3. 第一条 cDNA 链的合成

（1）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP 溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；

（2）加入1uL 5’ 端 cDNA 溶液以及引物 GSP1、Q0和 QT各25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 的阴性对照反应管，以确定阳性信号来源于cDNA；

（3）放入 PCR仪，98°C 5 min 变性，冷却至 48°C 保温 2min，72°C 40 min 延伸；

（4）进行循环：94°C 10 sec，GSP1 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第一条 cDNA 链产物溶液

4.第二条 cDNA 链的合成

（1）将第一条 cDNA 链产物溶液用 Tris-EDTA 溶液稀释 20 倍；

（2）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；

（3）取 1uL 稀释后的第一条 cDNA 链产物溶液，加入引物 GSP2 和 QI 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管；

（4）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性；

（5）进行循环：94°C 10 sec，GSP2 的 Tm 值温度10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第二条 cDNA 链产物溶液。

5.产物分析
使用凝胶电泳分析最终的 PCR 产物，对 cDNA 鉴定可通过杂交或测序。

需要先确定模版 RNA 的完整性以及 RNA 中不含 Licl 或 SDS 等抑制逆转录的试剂

1. RNA 模版在逆转录前通过凝胶检查完整性时发现条带不清晰，应立即丢弃 RNA，重新制备。

2. 5’ 加尾试剂质量差，可通过以下方式检测试剂质量：尝试将 Poly（A）尾加至 100-300bp DNA 片段上 30min，并设立对照（无 Tdt），再通过琼脂糖凝胶分析两个样品，结果应是一个紧致的片段，并且大小应增加 20-200bp，作为扩散带，逐渐减弱成更高分子量的产物，如若不是，立即更换试剂。