race实验中特异性引物如何设计？有没有什么判断标准？

引物设计

使用锁定引物(lock docking primer)：在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸MN（结构为5′-oligo(dT)16-30MN-3′，M=A/G/C；N=A/T/C/G）。使用锁定引物可使引物定位在poly(A)起始位点，消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位结合所带来的影响。

3′RACE以3′末端的poly(A)序列设计逆转录引物时，使用oligo(dT)和一段接头序列作为引物（图1），这样就在cDNA末端接上了一段特殊的接头序列，在得到第一条cDNA链之后，依据接头序列设计基因特异性引物，如此则后续的PCR扩增中一对引物均为基因特异性引物，可以有效提高扩增的特异性。

5′RACE在以第一条cDNA链3′末端的poly(C)计扩增引物时，使用poly(G)和一段接头序列作为引物（图2），在第二条cDNA链后接入一段特殊的接头序列。依据接头序列设计基因特异性引物，并用此引物与根据已知cDNA序列设计的基因特异性引物作为一对引物进行PCR扩增。

race实验设计引物的要求:引物长度以20-28 nt为宜。引物中的GC含量一般为45%-55％,GC、AT分布均匀,应尽量避免局部富含GC或AT。引物最好不形成二级结构（发夹结构等）,与5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer不能形成复杂结构。引物3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列.