3’RACE 实验心得

引子：从06年12月份开始，断断续续做了一个多月的3’RACE，有了一些心得和体会。期间看了很多前辈们分享的经验，受益匪浅。在这里，我就自己的经历略作总结，希望能给像我一样的新人们有点启示，少走些弯路，不当之处欢迎指正。

一、试剂盒的选择：3’RACE从原理上就能明白，它比5’RACE 要容易得多，所以并不一定需要用进口试剂盒。原来准备用Takara 3’RACE的试剂盒，可是看了一下它的原理和内容，觉得挺挫的，自己DIY可能效果更好一些呢。于是根据 Invitrogen GeneRacer Kit 自己DIY了，效果不错。找来了：Invitrogen的SuperScript III反转酶，TAKaRa　LA Taq酶、Pyrobest高保真酶。
并根据 Invitrogen GeneRacer Kit，自己合成了3’接头引物(侵犯了人家知识产权)：
3’接头：3'ap 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 -3'
54 bases
3’外侧：3'Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′ 25bases 76°C
3’内侧：3’Nested Primer 5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′ 23bases 72°C

二、体会与心得
１、RNA的质量： RNA的质量对于3’RACE的成功至关重要， RNA的质量不好，其他全是白忙活。刚开始用了师兄半年前的RNA做不出来，后发现是由于RNA降解了，用新的RNA后问题就解决了。
所以提完了RNA后别怕麻烦，验证一下质量再往下做（看看OD260/280的值，再电泳检查一下），免得后面出了问题都没法找原因。
２、引物质量：引物的重要性也是在实验过程中慢慢体会到的，它往往是决定性的因素。刚开始为保险起见，我对应Invitrogen GeneRacer Kit提供的3’引物设计了内外两对引物(准备做巢式PCR，GSP1- 3’Primer and GSP2- 3’Nested Primer )，BTW：Invitrogen认为较高退火温度的引物特异性好一些。
　　刚开始按部就班的做，先用GSP1- 3’Primer去扩增 ，再用GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。也遇到了RACE常见的问题，3’-race第一轮PCR目的条带非常弱（没法回收），还伴有严重的smear。
　　这就要解决二个问题： １）减少非特异性扩增。 ２）增加目的片段的产量。当时，优化了一些PCR条件，试了Touch down PCR，也用第一轮PCR产物作模板用GSP1引物做二次PCR ，也用了GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。Touch down PCR、二次PCR的效果都不好。用巢式 PCR能得到目的片断，但效果也不怎么样。
　　后来，一次心血来潮直接用GSP2- 3’Nested Primer做第一轮PCR，直接就扩增到了效果较好的目的片段（如下图），后来用高保真酶扩增时也只需要一轮PCR 就可以了。由此可见，引物的质量是决定性的。一对好的引物，不需要很费事的去优化条件就能得到好的结果；而一对特异性不怎么好的引物，即使用很多方法去优化也很难得到理想的结果。

３、扩增条件的优化：影响PCR的因素很多,但我觉得这其中模板质量、引物质量、引物退火温度是最具决定性的因素。而诸如：模板浓度、引物浓度、热启动、酶量、延伸时间、PCR循环次数、是否Touch down PCR，这些都是锦上添花的因素。
也就是说，如果目的条带能扩增出来，优化一下条件能扩增得更好；但是如果目的条带压根就扩不出来，你在这些锦上添花的东西上花再多精力也没用，这时候就应该考虑在决定性因素上找找原因。

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